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外植体

植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。在继代培养时,将培养的组织切段移入新的培养基时,这种切段也称外植体。外植体通常选择生长健壮的无病虫的植株上正常的器官或组织,因为它代谢旺盛,再生能力强。此外,靠近植株的近基部比较易成功。

植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。在继代培养时,将培养的组织切段移入新的培养基时,这种切段也称外植体。

制备原生质体的供体材料来源于植物的各类组织、器官、细胞或是由之建立的细胞无性系。其中使用最多的是各种植物的叶片、愈伤组织和悬浮培养细胞,次之是根尖、茎尖和子叶。

所用植物材料的生理状态(如光照时间、光强、光质、温度、湿度、营养等)对原生质体的产量和存活具有 显著影响。即使是由生长在相同条件下的外植体如叶片、胚轴、根尖等制备的原生质体,甚至是同一类型外植体所制备的原生质体,在离体培养时对各种培养基或培养条件的反应也会有不同。因此,供试植株最好生长在可控条件下,且最好用无菌苗培养。无菌苗培养物有一层很薄的表皮,酶混合物容易通过;又由于它们本身无菌,因而避免了由于表面消毒可能导致的破坏,此种来源的原生质体在生理上和遗传特性上比较一致,也较易用酶法进行分离。用于原生质体制备的组织培养材料可以是质地松散的愈伤组织,但更多的是各种植物的悬浮培养细胞,一般选用继代培养3~5d的悬浮细胞作为材料。在这种细胞群体中,主要是单细胞或细胞团,细胞壁容易酶解。另外,包括大量幼嫩的分生组织细胞以及次生细胞壁较少的外植体,在酶法去除细胞壁后,原生质体很快被释放出来,而且原生质体经融合后容易进行细胞分裂和再生。大量的分生组织细胞意味着对再生分化培养基有很好的适应能力,更能显示出细胞分裂,产生体细胞胚和子叶。有证据表明,有些植物只有从具有分化潜力大的外植体,如未成熟胚、幼花序、幼叶或成熟胚来诱发愈伤组织,从中选出胚性细胞系,再用以制备原生质体才能得到再生植株。

植物组织培养的材料几乎包括了植物体的各个部位,如茎尖、茎段、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。

(1)茎尖

茎尖不仅生长速度快,繁殖率高,不容易发生变异,而且茎尖培养是获得脱毒苗木的有效途径。因此,茎尖是植物组织培养中最常用的外植体。

(2)节间部

大部分果树和花卉等,新梢的节间部是组织培养的较好材料。新梢节间部位不仅消毒容易,而且脱分化和再分化能力较强,也常用作组织培养的材料。

(3)叶和叶柄

叶片和叶柄取材容易,新出的叶片杂菌较少,实验操作方便,是植物组织培养常用的材料。尤其是近年在植物的遗传转化中,以叶片为试验材料的报道较多。

(4)鳞片

水仙、百合、葱、蒜、风信子等鳞茎类植物常以鳞片为材料。

(5)其他

种子、根、块茎、块根、花粉等也可以作为植物组织培养的材料。但是,不同种类的植物以及同种植物不同的器官对诱导条件的反应是不一致的。如百合科植物风信子、虎眼万年青等比较容易形成再生小植株,而郁金香就比较困难。百合鳞茎的鳞片外层比内层的再生能力强,下段比中、上段再生能力强。选取材料时要对所培养植物各部位的诱导及分化能力进行比较,从中筛选出合适的、最易表达全能性的部位作为外植体 [1]

(1)选择优良的种质

无论是离体培养繁殖种苗,还是进行生物技术研究,培养材料的选择都要从主要的植物人手,选取性状优良的种质或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的,具有一定的代表性,以提高成功的几率,增加其实用价值。

(2)选择健壮的植株

选取发育正常的器官或组织,再生能力强,组培易成功。组织培养用的材料,最好是从生长健壮的无病虫的植株上选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛,再生能力强,培养后比较容易成功。此现象可能是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持所致。

(3)选择适宜的部位

植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功,这些部位包括茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表皮、块茎的储藏薄壁细胞、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应是不一致的,有的部位诱导分化率高,有的部位很难脱分化,或者再分化频率很低。

(4)选择适当的时期

组织培养选择材料时,要注意植物的生长季节和生长发育阶段,对大多数植物而言,应在其开始生长或生长旺季采样,此时材料内源激素含量高,容易分化,不仅成活率高,而且生长速度快,增殖率高。若在生长末期或已进入休眠期时采样,则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材,这时比较容易形成愈伤组织。百合在春夏季采集的鳞茎、片,在不加生长素的培养基中,可自由地生长、分化;而其他季节则不能。叶子花的腋芽培养,如果在1~2月采集,则腋芽萌发非常迟缓;而在3~8月采集,萌发的数目多,萌发速度快。对于大多数植物而言,应在其生长季节开始时采样。在生长末期或已进入休眠期时取样,外植体可能对诱导反应迟钝或无反应,较难成活。

(5)考虑器官的生理状态和发育年龄

一般认为,生理年龄小的幼嫩组织较生理年龄大的成熟衰老组织具有较高的形态发生能力。随着组织年龄的增加,器官的再生能力逐渐减弱甚至完全失去再生能力。

(6)材料大小的选择要适宜

建立无菌材料时,取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染,材料太小,多形成愈伤组织,甚至难于成活。一般选取培养材料的大小为0.5~1.0 cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料,则应更小。

植物的基因型对外植体褐变发生频率、程度都存在根本性影响,轻者影响细胞生长和繁殖,重者导致细胞死亡。这是由于基因会从根本上导致植物体内相关物质合成量有差异。在木本植物中,单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变, 这是由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁或色素的合成前体, 酚类化合物含量高, 木质素单宁或色素形成就多, 而酚类化合物含量高将导致褐变的发生,因此,木本植物一般比草本植物更容易发生褐变。在植物组织培养中,不同物种之间褐化程度差异很大, 就是同种植物的不同品种间也存在一定差异, 在比较两类葡萄品种的褐变时, 发现酚类物质含量与褐变发生具有正相关性。同一种植物中, 幼龄材料一般比成龄材料褐变轻。马文卿等证实, 大花蕙兰是易褐化的植物, 由基因型导致外植体诱导和试管苗增殖中均存在褐化现象 [2]

外植体取材的不同状态具体表现为外植体生理状态、取材部位、取材时期、外植体的大小及受伤程度、外植体预处理等。幼龄材料比成龄材料褐变轻, 这可以用幼龄材料的酚类化合物含量少, 而成龄材料多来解释。平吉成在研究小金海棠、八楞海棠和山定子刚生成的实生苗上切取茎尖进行组培的试验中, 发现接种后褐变很轻。高度分化的叶片作为外植体,接种后则很容易褐变, 而在幼嫩器官或组织(如胚)中, 褐变则较轻。植物体内酚类化合物含量、PPO(多酚氧化酶)活性与外植体所处的生长季节有关, 而PPO活性和酶类含量有正相关性, 春秋季较弱, 随着生长季节的到来, 酶活性逐渐增强, 所以早春和秋季取材较为适宜。Wang等也报道“富士”苹果和“金华”桃5 ~ 8 月取材褐变严重,而在9 月到翌年2月取材褐变有所减轻, 核桃的夏季材料比其他季节材料更易褐变。外植体大小对褐化的影响,表现为小的材料更易发生褐化, 相对较大的材料褐化的程度则较轻。由于膜结构或细胞中物质区域化分布的破坏是酚类物质酶促褐变的重要因素,切口越大导致酚类物质的被氧化面也越大, 褐化程度会更严重。Bonga等在巨桉和卡德兰的组织培养中得出, 外植体越小, 切面与体积的比率越大, 伤害及褐化的程度越大。除了机械伤害外, 接种时各种化学消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变。组培中常用酒精和升汞消毒。Ziv等用0.3-升汞代替Ca(ClO)2 进行消毒,可降低鹤望兰的褐变程度。一般来说, 延长外植体消毒时间会使消毒效果增加, 但对外植体伤害也大, 从而加剧褐变。因而消毒时间应掌握在一定范围内, 才能保证较高的外植体存活率。

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