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DNA连接酶

DNA连接酶(DNA Ligase)也称DNA黏合酶,在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色,那就是连接DNA链3‘-OH末端和,另一DNA链的5’-P末端,使二者生成磷酸二酯键,从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。连接酶的催化作用需要消耗ATP。

DNA连接酶也称DNA黏合酶,在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色,那就是把两条DNA黏合成一条。无论是双股或是单股DNA的黏合,DNA黏合酶都可以借由形成磷酸酯键将DNA在3'端的尾端与5'端的前端连在一起。虽然在细胞内也有其他的蛋白质,例如像是DNA聚合酶在其中一股DNA为模版的情况下,将另一边的DNA单股断裂端,通过聚合反应的过程形成磷酸双脂键(phosphodiester bond)来黏合DNA(DNA连接酶将DNA片段缝合起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸双脂键)。但是DNA聚合酶的黏合过程却只是聚合反应一个附带的功能而已,真正在细胞内扮演DNA黏合反应的工作还是以DNA黏合酶为主。DNA黏合酶的功能便是黏合断裂的DNA,而细胞内只有DNA复制DNA修复的反应牵涉到DNA断裂的合成,因此DNA黏合酶就是在上述的两个机制扮演重要的角色。除了细胞内的黏合反应,随着分子生物学的进展,几乎大多数的分子生物实验室都会利用DNA黏合酶来进行重组DNA的实验,或许这也可以被规类为其另一种重要的功能。

DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的,最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶,借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外),而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75Ku的多肽链。对胰蛋白酶敏感,可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性,可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物,但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子,和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近,这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合,填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用,连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。

噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链,分子量为60Ku,其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外,NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率,而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶,还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。

DNA连接酶主要用于基因工程,将由限制性核酸内切酶“剪”出的粘性末端重新组合,故也称“基因针线”。

人教版高中生物选修3中提到的EcoliDNA连接酶,来源于大肠杆菌,可用于连接粘性末端;T4DNA连接酶,来源于T4噬菌体,可用于连接粘性末端和平末端,但连接效率低。

T4DNA连接酶

T4DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶,催化两条DNA双链上相邻的5′磷酸基和3′羟基之间形成磷酸二酯键。可接双链DNA的平末端、相容黏末端及其中的单链切口,在分子生物学中有广泛的应用。T4DNA连接酶是经原核表达柱层析纯化获得的高纯T4DNA接酶,SDS-PAGE显示为一条62kD的蛋白条带。本品附带10xLigationBuffer含有ATP。适用于DNA片断接、克隆等各种反应。

内容与储存方法

名称:T4DNALigase数量:20ml 保存条件:-20℃

名称:10xLigationBuffer 数量:100ml 保存条件:-20℃T4DNA接酶活性为3u/ml,单位定为Weiss单位(0.01Weiss单位活性的T4DNA接酶在16℃时20ml体系反应20分钟,可以连接95-的1gλDNA-HindIII的酶切物)。无DNA外切酶或内切酶活性。可进行50次以上常规DNA接反应。低温运输,-20℃保存。有效期6个月。

10×LigationBuffer成分

Tris-HClpH7.8600mM

MgCl215mM

DTT100mM

ATP10mM

连接条件

推荐在10~20ml反应体系中进行接反应,反应中DNA浓度最大可达1mM(1kbDNA约1mg/ml)。首先混合要接的DNA片段,加入10×LigationBuffer至终浓度为1×,再加入适量T4DNALigase混匀。最适连接温度为16℃。粘末端连接效率较高,加入0.2~1mlT4DNALigase,可在室温或16℃反应1~3小时完成反应;平末端连接效率较低,加入1mlT4DNALigase,通常需要在16℃或4℃过夜完成反应。

注意事项

1)10xLigationBuffer含有ATP,使用前应在室温放置至融化或用手掌温度辅助融化,然后置于冰上。不要加热融化以免ATP降解。

2)T4DNALigase对热敏感,容易失活。使用时请放置冰上,用后立即置冰箱中冷冻保存

3)如需在接反应后灭活T4DNALigase,可于65℃孵育10min即可。

热稳定DNA连接酶

热稳定的DNA连接酶(thermostableDNAligase),是从嗜热高温放线菌(Thermoactinomycesthermophilus)菌株中分离纯化的,一种能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接作用的一种核酸酶。在85℃高温下都具有连接酶的活性,而且在重复多次升温到94℃之后也仍然保持连接酶的活性。在基因克隆实验中具有重要作用。

限制性核酸内切酶(以下简称限制酶):限制酶主要存在于微生物(细菌、霉菌等)中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且能在特定的切点上切割DNA分子。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶(“分子手术刀”)。发现于原核生物体内,现已分离出100多种,几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。例如,从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列,并在G和A之间将这段序列切开。目前已经发现了200多种限制酶,它们的切点各不相同。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因,就能被某种限制酶切割下来。在基因工程中起作用。

DNA连接酶:主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键,起连接作用,在基因工程中起作用。基因工程中,大肠杆菌连接酶只连接黏性末端,而T4连接酶既可连接黏性末端,又可连接平末端。

DNA聚合酶:主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,在DNA复制中起做用。

DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上,形成磷酸二酯键;而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。

DNA聚合酶是以一条DNA链为模板,将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链;而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。RNA聚合酶(又称RNA复制酶、RNA合成酶)的催化活性:RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板,转录时DNA的双链结构部分解开,转录后DNA仍然保持双链的结构。真核生物RNA聚合酶:真核生物的转录机制要复杂得多,有三种细胞核内的RNA聚合酶:RNA聚合酶I转录rRNA,RNA聚合酶II转录mRNA,RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。在RNA复制和转录中起作用。

反转录酶:RNA指导的DNA聚合酶,具有三种酶活性,即RNA指导的DNA聚合酶,RNA酶,DNA指导的DNA聚合酶。在分子生物学技术中,作为重要的工具酶被广泛用于建立基因文库、获得目的基因等工作。在基因工程中起作用。

解旋酶:是一类解开氢键的酶,由水解ATP来供给能量它们常常依赖于单链的存在,并能识别复制叉的单链结构。在细菌中类似的解旋酶很多,都具有ATP酶的活性。大部分的移动方向是5'→3',但也有3'→5'移到的情况,如n'蛋白在φχ174以正链为模板合成复制形的过程中,就是按3'→5'移动。在DNA复制中起做用。

DNA限制酶作用于磷酸二酯键

DNA连接酶作用于磷酸二酯键

DNA聚合酶作用于磷酸二酯键

DNA解旋酶作用于氢键

目前已知有三种方法可以用来在体外连接DNA片段:

第一种方法是,用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段;

第二种方法是,用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来,或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly(dA)-poly(dT)尾巴之后,再用DNA连接酶将它们连接起来;

第三种方法是,先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头,使之形成粘性末端之后,再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异,但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。

粘性末端DNA片段的连接

DNA连接酶最突出的特点是,它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用,形成重组的DNA分子。

平末端DNA片段的连接

常用的平末端DNA片段连接法,主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。

同聚物加尾法

这种方法的核心部分是,利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能。末端脱氧核苷酸转移酶是从动物组织中分离出来的一种异常的DNA聚合酶,它能够将核苷酸(通过脱氧核苷三磷酸前体)加到DNA分子单链延伸末端的3′-OH基团上。由核酸外切酶处理过的DNA,以及dATP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中,DNA分子的3′-OH末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的DNA单链延伸。这样的延伸片段,称之为poly(dA)尾巴(图2-7)。反过来,如果在反应混合物中加入的是dTTP,那么DNA分子的3′-OH末端将会形成poly(dT)尾巴。因此任何两条DNA分子,只要分别获得poly(dA)和poly(dT)尾巴,就会彼此连接起来。这种连接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴连接法(homopolymertail-joining),简称同聚物加尾法。

衔接物连接法

所谓衔接物(linker),是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点平末端的双链寡核苷酸短片段。衔接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端,用多核苷酸激酶处理使之磷酸化,然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子,这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是我们便可以按照常规的粘性末端连接法,将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。

DNA接头连接法

DNA接头,是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后,便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子,而易于连接重组。实际使用时对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造,可避免处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间发生彼此间的配对连接。

也称耐高温DNA聚合酶

1988年,Saiki从嗜热水生真菌Thermus aquatics YT-1株中分离得到,该菌株于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离出。

特性

良好的热稳定性;

70℃ 2h,残留90-活性;

93℃ 2h,残留60-活性;

94℃ 2h,残留40-活性。

5’→3’聚合酶活性,对dATP有优先聚合活性;

5’→3’外切酶活性;

无3’→5’外切酶活性。

用途

聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)。

Taq酶扩增的PCR产物,3’末端总是带有1个非模板依赖型的突出碱基,而这个碱基几乎总是A,因为Taq酶对dATP具有优先聚合活性,故可用T载体克隆。

缺点

无3’→5’阅读校正功能,在PCR扩增过程可引起错配,30次循环错配率约0.25-。

措施:选择高保真Taq酶,如Pfu。

原因:Pfu具有3’→5’外切酶活性。

注意:Pfu扩增产物为平末端

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