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酶蛋白

酶蛋白是指酶的纯蛋白部分,是相对于辅酶因子而言,又称为脱辅基酶蛋白,其单独存在时不具有催化活性,与辅酶因子结合形成全酶后才显示催化活性。酶蛋白目前主要的用与饲养业。酶蛋白以植物蛋白为原料,酵母菌为主菌,辅以产酶、产维生素的7种菌进行复合发酵,改善植物蛋白结构,富含消化酶系、菌体蛋白、维生素制作的饲料。可以增强鸡体抵抗力,减少死亡率。用酶蛋白部分或全部替代鱼粉,蛋鸡生产性能、体重、鸡蛋品质等与不替代差异均不显著,还能补充酶系及有益微生物,降低试鸡死亡率,经济效益明显。

在由复合蛋白质构成的酶中,特别是能利用透析和其它方法可逆地解离其低分子成分时,称蛋白部分为脱辅基酶蛋白,低分子部分为辅酶,具有两者结合催化效应的复合蛋白质称为全酶。即辅酶+脱辅基酶蛋白全酶。当辅酶的结合强固时称为辅基,例如硫胺素焦磷酸丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.1)的辅酶,从全酶分离出后再加入到脱辅基酶蛋白中恢复其催化作用。NAD与其说是辅酶,不如说是底物。由于脱辅基酶蛋白的某个脱氢酶的作用而转变为它的还原型,此还原型可由其它脱氢酶等的作用而被氧化。

某些为催化活性所必需的,与酶蛋白疏松结合的小分子量的有机物质。一部分酶除蛋白质部分外,尚含有对它们的功能直接有关的一些无机或有机成分,这些成分统称为酶的辅因子,如果缺少这些成分,酶就显不出活性。

辅因子包括金属离子和一些分子量不大的有机化合物。一般常见的金属离子有锌离子(Zn()、镁离子(Mg()、铁离子(Fe()、铜离子(Cu()等,例如醇脱氢酶含锌、精氨酸酶含锰、而多酚氧化酶则含铜等。

与酶蛋白结合很松弛,用透析和其它方法很易将它们与酶分开的称为辅酶(Coenzyme)还有激活剂与辅基之分。辅酶尽管不同于酶的底物,但在作用方式上和底物类似,在酶反应过程中与酶结合、分离及反复循环。辅酶用量确定可将它们按底物处理。例如乳酸脱氢酶中辅酶按底物动力学方程计算。

有不少酶既含有金属辅因子也含有辅酶。许多辅酶是或维生素的衍生物。作为辅酶的B族维生素及其衍生物 20世纪前50年在维生素研究中的突出成就就是分离和鉴定了许多维生素(特别是B族维生素)并阐明了它们在人体内的作用。发现不少维生素类(特别是B族维生素或其衍生物)是有机体中一些重要酶类的辅酶,它们的需要量虽不多但必须从食物中摄取。

在几种重要的代谢反应中起作用。在二羧酸的异构作用中,例如在谷氨酸转化为甲基天冬氨酸的酶促反应中,在乙二醇甘油转化为醛类,生物合成甲基基团以及核苷的合成中需要辅酶B12。根据酶催化反应最适条件的要求,原则上在酶测定体系中应加入一定量的辅助因子。脱辅基酶蛋白与辅基孵育一段时间后,酶活性才会恢复,因此,往往需要样品与试剂中的辅基先预孵育的过程。辅基的用量往往较少。

辅酶尽管不同于酶的底物,但在作用方式上和底物类似,在酶反应过程中与酶结合、分离及反复循环。辅酶用量的确定可将它们按底物处理。例如乳酸脱氢酶中辅酶按双底物动力学方程计算。

激活剂(activator)的化学本质是金属离子,可以是酶的活性中心,也可以通过其他机制激活酶的活性。作为激活剂的金属离子,其影响酶促反应的动力学更加复杂。最常见的是二价金属离子如Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等。重金属离子大多是酶的变性剂。金属离子之间往往存在相互拮抗或相互抑制。在酶测定体系中经常加入EDTA目的是螯合一部分非必要的离子。合适的金属离子浓度是必要的,过量的离子往往抑制酶反应速度。由于激活剂的动力学往往与酶的动力学不同,这就可以解释不同的样品与反应液的比例,造成酶活性测定结果的不呈比例。N-乙酰半胱氨酸对肌酸激酶的激活作用与此类似。激活剂的用量一般通过反复实验来确定。

酶蛋白浓度测定的方法:酶浓度严格来说是指酶分子的质量浓度,常以酶蛋白浓度来表示。人体体液中的酶有几百种,除LPS、LCAT、ChE、铜氧化酶(CER)外,大多数酶的含量在μg/L水平甚至更低。因此,酶活性浓度的测定是主要测定方法。20世纪70年代以后,随着新技术特别是免疫学技术的发展,酶的定量分析技术中出现了许多利用酶蛋白的抗原性,通过抗原抗体反应直接测定酶蛋白质量的新方法。国内外曾使用电泳法、柱层析法、免疫化学法等测定酶浓度,其中以免疫化学法应用较广。免疫化学法是利用酶蛋白的抗原性,制备特异性抗体后用免疫学方法测定酶浓度。用于酶浓度测定的免疫化学方法有:免疫抑制法、免疫沉淀法、放射免疫测定(RIA)、化学发光免疫测定(CLIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光酶免疫测定(FEIA)等。其中,前两种方法可用于酶活性浓度测定,其他方法则用于酶蛋白浓度测定。例如,如免疫抑制法测定CK-MB的活性、免疫沉淀法(单向扩散法)法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性;RIA测定胰蛋白酶和弹性蛋白酶浓度、CLIA测定CK-MB的浓度、ELISA测定神经元特异性烯醇化酶(NSE)浓度等。

CK-MB是诊断AMI、测定心肌梗塞面积的重要指标。国外对AMI诊断效率评价时多采用测定CK-MB质量,即测定CK-MB的酶蛋白质量浓度(Mass)的方法。CK-MB质量的测定通常是制备抗CK-M抗体和抗CK-B抗体或采用CK-MB抗体,用CLIA、ELISA、FEIA等方法测定。这些方法适用于临床自动化分析,具有测定时间短(最快仅需7min)、灵敏性高(最低检测限<&micro;g/L)和准确性好的特点,明显优于其他分析测定CK-MB的方法,1990年后逐渐被广泛接受。为使CK-MB质量分析标准化,AACC成立了专门的标准化委员会,已研制成功采用重组基因技术的CK-MB参考材料(Rck-2)。

由于酶浓度测定方法的不同,报告方式也有差异:酶活性浓度单位常以U/L报告,酶质量(mass)浓度单位常直接用ng/ml或mg/L报告。临床医生应注意报告方式不同所带来的差异。

免疫化学法测定酶蛋白浓度的优缺点与传统的酶活性测定法相比,免疫化学测定法的优点主要有:①灵敏度高,灵敏度达到ng/L至μg/L的水平,能测定样品中用原有其他方法不易测出的少量或痕量酶;②特异性高,几乎不受体液中其他物质,如酶抑制剂、激活剂等的影响,不受药物的干扰;③能用于一些不表现酶活性的酶蛋白的酶测定,如各种酶原或去辅基酶蛋白,或因遗传变异而导致合成无活性的酶蛋白,以及失活的酶蛋白等;④在某些情况下,与酶活性测定相结合,计算免疫比活性,能提供更多的具有临床应用和研究价值新的资料和信息。⑤特别适用于同工酶的测定。

酶的免疫化学测定也有其局限性。主要表现在:①要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的,而且工作量很大;②测定步骤多,操作繁琐;③测定成本高。因此,必须熟练掌握免疫化学技术,掌握抗原抗体复合物形成的最佳条件,不断降低成本,才能既保证测定结果准确,又能在临床广泛推广使用。

以免疫分析为基础的仪器(dca2000)在最近几年中得到推广酶蛋白,大约在7分钟内就能读取数据,并且仅使用少量的毛细血管血液标本,因此,在糖尿病门诊,用糖化血红蛋白评价糖尿病患者血糖控制的平均水平已成为常规。hbalc正常参考值为<6-,而在血糖控制良好的糖尿病患者应为<7-。当糖尿病患者的血糖控制不佳,或一天中血糖有较大的波动时,糖化血红蛋白值就会超过7-的允许值。美国糖尿病协会建议,酶蛋白对已明确的1型糖尿病患者,每季度进行一次糖化血红蛋白检查

酶蛋白以植物蛋白为原料,酵母菌为主菌,辅以产酶、产维生素的7种菌进行复合发酵,改善了植物蛋白结构,富含消化酶系、菌体蛋白、维生素制作的饲料。通过试验表明:鸡,鸭等家禽在产蛋高峰期,体内消化酶相对不足,代谢极为旺盛,对营养因子和致病因子均非常敏感,体质相对虚弱,抗病力下降,消化酶活性减弱,同化作用降低(周玉吉,1992)。酶蛋白可补充消化道内消化酶和维生素,促进了消化机能,提高了饲料利用率。酶蛋白富含芽孢杆菌、双歧杆菌、乳酸菌、酵母菌等有益微生物。饲喂有益微生物可使肠病原菌逐渐下降。Fuller(1989)认为,直接使用有益微生物饲喂动物,可提高抗体水平或巨噬细胞活性,增强机体免疫力。故使用酶蛋白可以增强鸡体抵抗力,减少死亡率。用酶蛋白部分或全部替代鱼粉,蛋鸡生产性能、体重、鸡蛋品质等与不替代差异均不显著,还能补充酶系及有益微生物,降低试鸡死亡率,1kg鸡蛋的饲料成本比使用鱼粉要降低10.32-~15.01-,经济效益明显。

为了顺应饲料业的产业结构调整、提高养殖报酬、减少动物体内药残、制造绿色饲料的大趋势,扩大生物转化产品的应用,以替代传统粗加工原料和化学添加剂,已成为当前饲料发展的新方向。

饲用酶蛋白产品就是其优秀代表。生物酶制剂对提高禽畜等的产量和质量有着显著作用,如:可使家禽增重7--10-,禽蛋增产5--8-,生猪增重13-。另外,该种酶制剂还能提高牛奶、羊毛等畜产品的产量,改善皮毛质量,更重要的是能够节省大量的饲料。显而易见,饲用酶蛋白应用后的经济效益是非常显著的,这种产品越来越受到业内人士的关注。而且饲用酶蛋白产品可以多种中低价农副产品作为原料,特别是油厂副产品:菜粕豆粕,仅作为饲料原料出售,价格较低。而制成酶蛋白成品作为饲料蛋白源,用以替代或部分替代鱼粉等高价蛋白原料,售价显著提高,经济效益十分可观。酶蛋白产品中内含多种有益菌群,如改善动物消化性能、增进动物健康水平的的乳酸菌、酵母菌、双歧杆菌等,因此更可以替代抗生素,解决了细菌抗药性和药残问题,让群众吃上真正的放心肉。

饲用酶蛋白还含有多种酶类,如促进消化的淀粉酶、蛋白酶等、降解抗营养因子的纤维素酶、植酸酶等。与使用常规饲料相比,添加1--2-饲用酶蛋白,可以使猪日增重提高3--6-左右,料肉比下降10--12-,毛利润提高10--15-;肉鸡的增重提高1-左右,粗蛋白消化率提高20-,成活率提高9.7-;蛋鸡的产蛋率提高24.64-,料蛋率下降30.94-;鱼的个体增重50-左右。从以上数据可以看出使用饲用酶蛋白,对于养殖户可大大提高养殖报酬、对于饲料厂家则提高了饲料成品的附加值。

经调查研究发现中国的动物饲料构成更需要这种生物酶制剂。中国动物饲料组成中非淀粉多糖占主要成分,例如玉米11--12-、麸皮33-、大豆22-、干草37-。同时饲料中还含有相当数量的戊聚糖(玉米4-、小麦6-、大麦7.6-、黑麦8.9-),葡聚糖(小麦0.5-、大麦3.3-、黑麦1.2-)以及果胶、丹宁等。这些物质都不能被动物消化吸收,反而因其溶于水后成为胶体状态,还会增大肠道内容物的粘度,阻碍营养物质扩散,影响吸收利用,起到了所谓抗营养物质即抗营养因子的作用。而生物酶制剂有明显抑制抗营养因子的作用。

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