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胰蛋白酶

胰蛋白酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋白酶的一种,EC 3.4.4.4,是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中,作为消化酶而起作用。在胰脏是胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原被合成后,作为胰液的成分而分泌,受肠激酶,或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶,是肽链内切酶,它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用,而且还能限制分解糜蛋白酶原羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体,起活化作用。是特异性最强的蛋白酶,在决定蛋白质的氨基酸排列中,它成为不可缺少的工具。

中文名称:

胰蛋白酶

中文同义词:

胰蛋白酶;胰蛋白酶1:250(猪胰脏);胰蛋白酶1:300(猪胰脏);胰淀粉酶;胰液酵素;胰酶-EDTA溶液;胰蛋白酶1:250;蛋白酶类

英文名称:

Trypsin

英文同义词:

TRYPSIN;TRYPSIN, 1-250;TRYPSIN, 1-300;TRYPSIN-EDTA;TRYPSIN, HUMAN PANCREAS;TRYPSIN PORCINE;TRYPSIN, PORCINE PANCREAS;ec3.4.4.4

CAS号:

9002-07-7

分子式:

C6H15O12P3

分子量:

≈24000

EINECS号:

232-650-8

胰蛋白酶是从牛、猪、羊的胰脏提取,纯化获得的结晶,再制成的冻干制剂。易溶于水,不溶于三氯甲烷、乙醇、乙醚等有机溶剂。在pH1.8时,短时间煮沸几乎不失活;在碱溶液中加热则变性沉淀,Ca2+有保护和激活作用,胰蛋白酶的等电点为pH10.1。

牛胰蛋白酶原有229个氨基酸组成,含6对二硫键,其氨基酸排列顺序和晶体结构已被阐明。在肠激酶活自身催化下,酶原的N末端赖氨酸与异亮氨酸残基之间的肽键被水解,释放出来缬-天-天-天-天-赖6肽,生成有活性的胰蛋白酶。牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个,分子量23800 ,活性部位的丝氨酸残基是不可缺少的丝氨

酸蛋白酶。

猪胰蛋白酶的化学结构与牛胰蛋白酶十分相似,在氨基酸残基排列顺序中,只有41个氨基酸残基不同,但分子构型有很大区别。沉降系数S20W为2.77S,pI=10.8,热稳定性较牛胰蛋白酶稳定,Ca2+对酶的保护作用不及牛羊的明显,无螯合Ca2+的中心部位。有6对二硫键,断裂1~2个键,均不至于破坏酶分子的完整结构而保护了酶的活性。酶的活力分别相当于牛的72-及羊的61-。

羊胰蛋白酶与牛、猪的相似,但其活力略高于牛和猪的。

胰蛋白酶专一作用有碱性氨基酸精氨酸及赖氨酸羧基所组成的肽键。酶本身很容易自溶,由原先的β-胰蛋白酶酶转化为α-胰蛋白酶,再进一步降解为拟胰蛋白酶,乃至碎片,活力也逐步下降而丧失。

除存在于脊椎动物外,还存在于蚕、海盘车、姑、放线菌等范围广泛的生物体中。另外与高等动物的血液凝固和炎症等有关的凝血酶、纤溶酶、舒血管素等蛋白酶在化学结构和特异性等方面与胰蛋白酶具有密切的关系,可以认为这些酶是从共同的祖先酶在进化过程中分化而来的。胰糜蛋白酶与弹性蛋白酶在结构和催化机制方面也具有密切关系,但其特异性则完全不同。

胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。中国药品标准规定按干燥品计算,每1mg 的效价不得少于2500单位。 由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶,只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。白色或米黄色结晶性粉末。溶于水,不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24 000,pI 10.5,最适pH值7.8~8.5左右。pH>9.0不可逆失活。Ca2+对酶活性有稳定作用;重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。临床用于抗炎消肿,工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。

本品应从检疫合格的牛、羊或猪胰中提取,生产过程应符合现行版《药品生产质量管理规范》的要求。

本品为白色或类白色结晶性粉末。

取本品约2mg,置白色点滴板上,加对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐试液0.2ml,搅匀,即显紫色。

酸度

取本品,加水溶解并制成每1ml中含2mg的溶液,依法测定(2010年版药典二部附录ⅥH),pH值应为5.0~7.0。

溶液的澄清度

取本品,加0.9-氯化钠溶液溶解并制成每1ml中含10mg的溶液,依法检查(2010年版药典二部附录ⅨB),溶液应澄清。

糜蛋白酶-底物溶液的制备

取N-乙酰-L-酪氨酸乙酯23.7mg,置100ml量瓶中,加磷酸盐缓冲液(取0.067mol/L磷酸二氢钾溶液38.9ml与0.067mol/L磷酸氢二钠溶液61.1ml,混合,pH值为7.0)50ml,温热使溶解,冷却后再稀释至刻度,摇匀。冰冻保存,但不得反复冻融。

供试品溶液的制备

取本品适量,精密称定,加0.001mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含0.25mg的溶液。

测定法

取底物溶液2.0ml、0.001mol/L盐酸溶液0.2ml与上述磷酸盐缓冲液(pH 7.0)1ml,混匀,作为空白。取供试品溶液0.2ml与底物溶液(预热至25℃±0.5℃)3.0ml,立即计时并摇匀,使比色池内的温度保持在25℃±0.5℃,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典二部附录ⅣA),在237nm的波长处,每隔30秒读取吸光度,共5分钟,每30秒钟吸光度的变化率应恒定,且恒定时间不得少于3分钟。以吸光度为纵坐标,时间为横坐标,作图,取在3分钟内成直线部分的吸光度,按下式计算。

式中 P为每2500胰蛋白酶单位中含糜蛋白酶的量,单位;

A2为直线上开始的吸光度;

A1为直线上终止的吸光度;

T为A2至A1读数的时间,分;

W为测定液中含供试品的量,mg;

0.0075为在上述条件下,吸光度每分钟改变0.0075,即相当于1个糜蛋白酶单位。

每2500单位胰蛋白酶中不得多于50单位的糜蛋白酶。

干燥失重

取本品适量,以五氧化二磷为干燥剂,在60℃减压干燥4小时,减失重量不得过5.0-(2010年版药典二部附录ⅧL)。

底物溶液的制备

取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐85.7mg,加水溶解使成100ml,作为底物原液;取10ml,用磷酸盐缓冲液(取0.067mol/L磷酸二氢钾溶液13ml与0.067mol/L磷酸氢二钠溶液87ml混合,pH值为7.6)稀释成100ml,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典二部附录Ⅳ A),恒温于25.0℃±0.5℃,以水作空白,在253nm的波长处测定吸光度,必要时可用上述底物原液或磷酸盐缓冲液调节,使吸光度在0.575~0.585之间,作为底物溶液。制成后应在2小时内使用。

供试品溶液的制备

精密称取本品适量,加0.001mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含50~60胰蛋白酶单位的溶液。

测定法

取底物溶液3.0ml,加0.001mol/L盐酸溶液200μl,混匀,作为空白。另取供试品溶液200μl,加底物溶液(恒温于25.0℃±0.5℃)3.0ml,立即计时,混匀,使比色池内的温度保持在25℃±0.5℃,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典二部附录Ⅳ A),在253nm的波长处,每隔30秒钟读取吸光度,共5分钟。以吸光度为纵坐标,时间为横坐标,作图;每30秒钟吸光度的改变应恒定在0.015~0.018之间,呈线性关系的时间不得少于3分钟。若不符合上述要求,应调整供试品溶液的浓度,再作测定。在上述吸光度对时间的关系图中,取成直线部分的吸光度,按下式计算:

式中P为每1mg供试品中含胰蛋白酶的量,单位;

A1为直线上终止的吸光度;

A2为直线上开始的吸光度;

T为A1至A2读数的时间,分;

W为测定液中含供试品的量,mg;

0.003为在上述条件下,吸光度每分钟改变0.003,即相当于1个胰蛋白酶单位。

注射用胰蛋白酶

胰蛋白酶

血液生化检查> 酶类测定

同酶速率法测定。

同酶速率法测定。

同酶速率法测定。

(1)RIA法:阴性。

(2)酶速率法(37℃):十二指肠液:150~600μg/ml

(1)升高:急性胰腺炎、慢性胰腺炎(复发期)、胰腺癌、肾功能不全等。

(2)降低:胰腺外分泌功能不全(慢性胰腺炎后期)。

急性胰腺炎时血清胰蛋白酶可上升至正常人的2~400倍,一般在10~15天恢复正常。

急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌

胰蛋白酶为肽链内切酶,对精氨酸和赖氨酸肽链具有选择性水解作用,可使天然蛋白、变性蛋白、纤维蛋白和黏蛋白等水解为多肽或氨基酸。由于血清中含有非特异性抑肽酶,故胰蛋白酶不会消化正常组织,而能分解黏痰、脓性痰等黏性分泌物,能促进抗生素、化疗药物向病灶渗透。

1.用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、娄管等所产生的局部水肿、血肿、脓肿。

2.用于呼吸道疾患溶解黏痰和脓性痰。

3.用于治疗毒蛇咬伤,曾试用于竹叶青、银环蛇、眼镜蛇、蝮蛇等毒蛇咬伤的各型病人800余例,均获治愈。

1.肝肾出血、出血倾向及结核性脓肿患者禁用。

2.不可用于急性炎症及出血空腔中。

1.每次2.5~5mg,用蒸馏水5~10ml溶解。

2.一般应用:1次5000单位,每日1次肌注,用量酌情而定。为防止疼痛,可加适量普鲁卡因。局部用药视情而定,可配成溶液制剂(PH7.4~8.2,微碱性时活性最强)、喷雾剂、粉剂、油膏等,用作体腔内注射、患部注射、喷雾、湿敷、涂搽等。

3.治蛇毒:取注射用结晶胰蛋白酶2000单位1~3支,加0.25-~0.5-盐酸普鲁卡因(或注射用水)4~20ml稀释,以牙痕为中心,在伤口周围作浸润注射,或在肿胀部位上方作环状封闭1~2次。如病情需要可重复使用。若伤肢肿胀明显,可于注射本品30分钟后,切开伤口排毒减压(严重出血者例外),也可在肿胀部位针刺排毒。如伤口已坏死、溃烂,可用其0.1-溶液湿敷患处

1.不可作静注。用前需作划痕试验,应注意可能产生过敏反应。

2.吸取注射液后应另换针头,以免注射时疼痛。

3.外用时,可采用注射用制剂以缓冲液溶解,但必须在3小时内用毕。

1.注射局部疼痛、硬结。

2.本品可引起组胺释放,产生全身反应,有寒战、发热、头痛、头晕、胸痛、腹痛、
  皮疹、血管神经性水肿、呼吸困难、眼压升高、白细胞减少等。症状轻时不影响继续治疗,给予抗组胺药和对症药物即可控制,严重时应即停药。

3.本品偶可致过敏性休克。

胰蛋白酶能使痰、血凝块溶化变稀,易于引流排痰,加速创面愈合净化,促进肉芽组织增生,而不损伤正常组织,临床上有消炎消肿功能。

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ,如: D-Hanks 液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

1. 称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为 0.25 -,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调 PH 到 7.2 左右)或 PBS ( D-hanks )液中。搅拌混匀,置于 4℃ 内过夜。

2. 用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器( 0.22 微米微孔滤膜)抽滤除菌。

3. 分装成小瓶于 -20℃ 保存以备使用可!

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