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聚合酶链式反应

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年,PCR已发展到第三代技术。1973 年,台湾科学家钱嘉韵,发现了稳定的Taq DNA聚合酶,为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。

Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想:“经DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”

但由于当时基因序列分析方法尚未成熟,热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难,这种想法似乎没有实际意义。加上70年代初分子克隆技术的出现提供了一种克隆和扩增基因的途径,所以,Khorana的设想被人们遗忘了。

1985年,Kary Mullis在Cetus公司工作期间,发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作,却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。

1983年4月的一个星期五晚上,他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。

1983年12月,Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片段;

1985年10月25日申请了PCR的专利,1987年7月28日批准(专利号4,683,202 ),Mullis是第一发明人;

1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文,Mullis是共同作者;

1986年5月,Mullis在冷泉港实验室做专题报告,全世界从此开始学习PCR的方法。

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。

耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

10×扩增缓冲液

10μl

4种dNTP混合物(终浓度)

各100~250μmol/L

引物(终浓度)

各5~20μmol/L

模板DNA

0.1~2μg

Taq DNA聚合酶

5~10 U

Mg2+(终浓度)

1~3mmol/L

补加双蒸水

100 μl

其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量(或浓度)可根据实验调整,以上表格只提供大致参考值。

PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即:

引物(PCR引物为DNA片段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、dNTP模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。

引物有多种设计方法,由PCR在实验中的目的决定,但基本原则相同。PCR所用的酶主要有两种来源:Taq和Pfu,分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。

模板即扩增用的DNA,可以是任何来源,但有两个原则,第一纯度必须较高,第二浓度不能太高以免抑制

缓冲液的成分最为复杂,除水外一般包括四个有效成分:缓冲体系,一般使用HEPES或MOPS缓冲体系;一价阳离子,一般采用钾离子,但在特殊情况下也可使用铵根离子;二价阳离子,即镁离子,根据反应体系确定,除特殊情况外不需调整;辅助成分,常见的有DMSO、甘油等,主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构

PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则

①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。

②引物碱基:G+C含量以40-60-为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤嘧啶核苷酸的成串排列参照。

③引物内部不应出现互补序列。

④两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3 ′端的互补重叠。

⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70-,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。

⑥引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。

⑦引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子终止密码子等。

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PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。

模板的取材主要依据PCR的扩增对象,可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

标本处理的基本要求是除去杂质,并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌,可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA,经酚、氯仿抽提纯化,再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

①PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子②镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高,常用1.5mmol/L

③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制,20~200umol/L

④TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul)

⑤引物 浓度一般为0.1 ~ 0.5umol/L

⑥反应温度和循环次数

变性温度和时间 95℃,30s

退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃

延伸温度和时间 72℃,1min/kb(10kb内)

Tm值=4(G+C) +2(A+T)

循环次数 :一般为25 ~ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低,可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右,循环数超过30个以后,DNA聚合酶活性逐渐达到饱和,产物的量不再随循环数的增加而增加,出现了所谓的“平台期”。

(Initial denaturation)

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间

变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。

(Primer annealing)

退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略

延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

大多数PCR含25-35循环,过多易产生非特异扩增。

在最后一个循环后,反应在72℃维持10-30分钟.使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。

标准的PCR过程分为三步

(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA

(60℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。

(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸,合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性退火延伸,DNA含量即增加一倍。如图所示:现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。

PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素溴化乙锭EB)染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势。

PCR反应的特异性决定因素为:

①引物与模板DNA特异正确的结合;

②碱基配对原则;

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;

④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。

PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。

PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。

不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

pcr仪器的发展pcr温度循环至关重要,pcr扩增仪各参数必须准确。自perkin elmercetus公司第一台pcr扩增仪问世以来,现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。在短短的几年间,扩增仪经过几代的发展,不断采用新技术,并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。

为了便于了解和选购适宜的pcr实验设备,现将部分国内外pcr扩增仪列表如下;这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的,各有其优缺点。国产1109型dna扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b体积小,智能化与自动化程序高,可以兼做套式pcr,方便实用。以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数,可以达到节省劳动力的目的。在采用这些仪器作pcr试验之前,一般均应实测管内温度变化循环情况,以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度,用于修正设计的循环参数。温度滞后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形状(与铝块孔匹配程度)的影响,这对变温铝块式仪器影响更大些。对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器,在使用低于室温的温度来保冷pcr反应后小管时,应注意冷凝水的问题,勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。

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12000元/台

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PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失。

不出现扩增条带。

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及溴乙锭的使用, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特 异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,应用多 大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。

物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。

引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。

出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量,减少循环次数。

1)克隆PCR产物的最优条件是什么?

最佳插入片段:载体比需实验确定。1:1(插入片段:载体)常为最佳比,摩尔数比1:8或8:1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液,50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶插入片段共10ul。室温保温1小时,或4℃过夜。在这2种温度下,缺T-凸出端的载体会自连,产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求,为提高连接效率,需4℃过夜。

2)PCR产物是否需要用凝胶纯化?

如凝胶分析扩增产物只有一条带,不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带,可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高,这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆,而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。

3)如果没有回收到目的片段,还需要作什么对照实验?

A)涂布未转化的感受态细胞。

如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型的菌落。

B)转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率。

例如,将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后,用100ul铺板。培养过夜,产生1000个菌落。转化率为:产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA,用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA,用1/10铺板,共用1 ng DNA。转化率为:

1000克隆X103 ng /铺板1 ng DNA ug=106cfu/ ug

转化pGEM-T应用108cfu/ ug感受态细胞

如没有菌落或少有菌落,感受态细胞的转化率太低。

C)如用pGEM-T正对照,或PCR产物,产生>20-40蓝斑(用指定步骤108cfu/ug感受态细胞),表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4DNA连接酶(M1801,M1804,M1794)质量标准好无核酸酶污染,不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。

D)用pGEM-T或pGEM-T Easy载体,连接pGEM-T正对照,转化高频率感受态细胞(108cfu/ug),按照指定的实验步骤,可得100个菌落,其中60-应为白斑,如产生>20-40蓝斑,没有菌落或少有菌落,连接有问题。

4)对照实验结果好,却没有回收到目的片段,实验出了什么问题?

A)连接用室温保温1小时,能满足大多数克隆,为提高效率,需4℃过夜。

B)插入片段带有污染,使3`-T缺失,或抑制连接,抑制转化。为此,将插入片段和pGEM-T正对照混合,再连接。如降低了对照的菌落数,插入片段需纯化,或重新制备。如产生大量的蓝斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。

C)插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段,因受UV过度照射,时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体,不利于连接,DNA必需重新纯化。

D)带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料(TM042)。

E)高度重复序列可能会不稳定,在扩增中产生缺失和重排,如发现插入片段高频率地产生缺失和重排,需用重组缺陷大肠杆菌菌株,如SURE细胞

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系:

10×扩增缓冲液 10ul

4种dNTP混合物 各200umol/L

引物 各10~100pmol

模板DNA 0.1~2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+ 1.5mmol/L

加双或三蒸水至 100ul

PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。

②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基:参照引物设计的基本原则

④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃~94℃min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。

②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50-的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:

Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)

复性温度=Tm值-(5~10℃)

在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:

70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时, DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。

PCR实验室按规定需要四间,分别是1 试剂储存和准备区、2 标本制备区、3扩增反应混合物配制和扩增区、4扩增产物分析区,布局见图1。图1 四间PCR实验室区域设置

如果使用全自动分析仪,各区域可适当合并,我们建议将扩增区和产物分析区合并为扩增检测区即共三个间,布局见图2。

图2 三间PCR实验室区域设置

按国家卫生部的要求,进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序,即只能从试剂储存和准备区?标本制备区扩增反应混合物配制和扩增区?扩增产物分析区,避免发生交叉污染。各工作区必须安装适当的排风设备确保空气流向按单一方向。工作区的墙面、地面、办公用品等必须选用耐消毒药品腐蚀的材料。工作区必须有明确的标记,避免不同工作区域内的设备、物品混用。

各工作区域必须配备排风扇、空调、耐腐蚀地面和工作台面、更衣柜、鞋柜、专用办公用品、专用工作服和工作鞋、移动紫外灯等,保证安全卫生需要。

根据国家卫生部《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》,各工作区域必备仪器设备如下:

一 试剂储存和准备区

1.2-8℃和-15℃冰箱

2.混匀器

3.微量加样器(覆盖1-1000μl)

4.移动紫外灯(近工作台面)

5.消耗品:一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心)

6.专用工作服和工作鞋

7.专用办公用品

二标本制备区

1.2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱

2.高速台式冷冻离心机

3.混允器

4.水浴箱或加热模块

5.微量加样器(覆盖1-1000μl)

6.可移动紫外灯(近工作台面)

7.超净工作台

8.消耗品:与“试剂储存与准备区”的消耗品相同

9.专用工作服和工作鞋

10.专用办公用品

如需处理大分子DNA,应具有超声波水浴仪。

三基因扩增区和产物分析区

1. 全自动定量核酸扩增仪(含计算机、打印机)

2. 微量加样器(覆盖1-1000μl)

3. 可移动紫外灯(近工作台面)

4. 消耗品:与“试剂储存与准备区”的消耗品相同

5. 专用工作服和工作鞋

6. 专用办公用品

各工作区域必须有明确的标记,避免不同工作区域内的设备、物品混用。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服,以便于鉴别。当工作者离开工作区时,不得将各区特定的工作服带出。

3.实验室质量管理

PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班,并持证上岗。PCR实验室通过验收,实验室至少必须应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序(SOP)、建立系列质量管理文件等,确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求,确保检测结果准确、确保实验室卫生安全,确保实验室长期稳定运行。

1.递减PCR(touchdown PCR):前几循环温度逐渐下降。

2.逆转录PCR(RT-PCR):以由mRNA逆转录而来的DNA为模板,由此产生出来的DNA不带有内含子(基因中不具意义的段落),常应用于分子克隆技术。

3.热启动PCR(hot start PCR):以高热活化型核酸聚合酶进行反应,减少非专一性产物。

4.即时PCR(real-time PCR):PCR过程中利用萤光探针或染料定量检测,又称定量PCR(quantitative PCR)。

5.巢式PCR(nested PCR):先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量,再用高特异性引物扩增。

6.多重PCR(multiplex PCR):在同一个管中使用多组引物。

7.复原条件PCR(reconditioning PCR):PCR产物稀释10倍后重新放入原浓度的引物和dNTP等循环3次,以消除产物中的异二聚体。

8.dsRNA合成(dsRNA replicator):合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶与Phi6 RNA replicase;从双股DNA转录为对应的双股RNA(dsRNA)。可应用于RNAi实验操作。

9.COLD-PCR(co-amplification atlowerdenaturation temperature-PCR):用以检测突变或特殊等位基因的PCR应用技术。

用于治疗感染性疾病,肿瘤及遗传病

PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上,只要样本有一个病原体存在,PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10~100基因拷贝,而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题,可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。

定量PCR研究资料已表明,病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。许多研究表明,人类免疫缺陷病毒(HIV)感染后,潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关;也有研究表明,HIV病毒载量低于一定值时,没有传染性。

在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中发现,病毒的数量与某些药物的疗效相关。例如,干扰素治疗对肝炎病毒高拷贝者不敏感,低拷贝者敏感;而有些药物则具有显著降低病毒高拷贝的作用。

癌基因的表达增加和突变,在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变,而且能准确检测癌基因的表达量,可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。

几乎所有慢性骨髓性白血病患者都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成,定量PCR技术可通过检测BCR/ABL融合基因的表达确定微量残余恶性细胞存在的数量,以此作为治疗效果和估计复发的危险性的依据。

一些病毒致癌作用也与病毒载量有关,EB病毒载量的FQ-PCR检测结果已被用于鼻咽癌早期发现和随访。

PCR技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变开始的。基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡,用FQ-PCR检测各种珠蛋白基因表达差异,是地中海贫血诊断的有效手段。

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。

一、标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。
  二、PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
  三、PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
  四、实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。

一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。
  对照试验
  一、阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照。
  二、阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括:
  1.标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。
  2.试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染。
  三、重复性试验。
  四、选择不同区域的引物进行PCR扩增。

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