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目的基因

把需要研究的基因称为目的基因。(一般把需要分析的基因称靶基因,在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因,有时三者含义相近。所以有时有些书本上也笼统的称“用限制性核酸内切酶切割目的基因(靶基因)”)

简单的原核生物目的基因可从拟核中直接分离得到,但人类的基因分布在23对染色体上,较难从直接法中得到。

直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”,又叫“散弹射击法”。这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟,无论哪一颗弹粒击中目标,都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是:用限制酶(即限制性内切酶)将供体细胞中的DNA切成许多片段,将这些片段分别载入运载体,然后通过运载体分别转入不同的受体细胞,让供体细胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分别在受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增),从中找出含有目的基因的细胞,再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫,抗病毒的基因都可以用上述方法获得。

用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便,缺点是工作量大,具有一定的盲目性。

II型限制性内切酶可专一性地识别并切割特定的DNA顺序,产生不同类型的DNA末端。若载体DNA与插入的DNA片段用同一种内切酶消化,或靶DNA与载体DNA末端具有互补的粘性末端,可以直接进行连接。

DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端。当限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时,产生的是黏性末端,而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时,产生的则是平末端

简短的目的基因可在了解DNA一级结构或多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列的基础上人工合成。

大多数的目的基因是由mRNA合成cDNA反转录DNA)得到。从RNA入手,先从细胞提取总RNA,然后根据大多数真核mRNA含有多聚腺嘌呤(polyadenylic acid ,polyA)尾的特点,用寡聚dT纤维素柱将mRNA分离出,以mRNA为模板,在多聚A尾上结合12-18个dT的寡聚dT片段,作为合适的起始引物,在逆转录酶作用下合成第一条。

依据:基因的核苷酸序列,功能,在染色体中的位置,转录产物mRNA,翻译产物蛋白质的性质。

PCR是多聚酶链式反应的缩写,由穆里斯等人于1988年发明的,1993年获诺贝尔奖。PCR是一种在生物体外迅速扩增DNA片断的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份DNA拷贝。这项技术解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题,被广泛地应用于遗传疾病的疹断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面。PCR的原理是DNA双链复制的原理,将基因的核苷酸不断地加以复制,使其数量呈指数增长。利用PCR技术获取目的基因的前提,是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物(2种)。扩增的过程是:目的基因DNA受热变性后解旋为单链,引物与单链相应互补序列结合,然后在DNA聚合酶的作用下进行延伸,如此重复循环多次。

cDNA链,用碱或RNA酶水解除去mRNA,再用DNA聚合酶,最好是Klenow片段合成第二条DNA链。双链合成后,用S1核酸酶切去发夹结构,即可获得双链cDNA。cDNA用于探针制备、序列分析、基因表达等研究。因此以cDNA为研究材料,反映了mRNA的转录及对以后翻译的影响情况,即反映某一基因(DNA)外显子的情况。

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