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木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶(Papain),又称木瓜酶,是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜(Carieapapaya)中含有的一种低特异性蛋白水解酶,广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内,其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸,属于巯基蛋白酶,它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点,因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。

番木瓜未成熟果实中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶A(Chymopapain A )、木瓜凝乳蛋白酶B(Chym opapain B )、木瓜肽酶B (PapayaPeptidase B ) 等多种蛋白水解酶。且已知四种半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度的同源性。其中,木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶,可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端,并能优先水解那些在肽键的N-端具有二个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。

木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶,分子量为23406,由一种单肽链组成,含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位,他们分别是Cys25、His159和Asp158,当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时,酶的活力被抑制,而还原剂半胱氨酸(或亚硫酸盐)或EDTA能恢复酶的活力 [1] 。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有:(1)木瓜蛋白酶,分子量21000,约占可溶性蛋白质的10-;(2)木瓜凝乳蛋白酶,分子量26000,约占可溶性蛋白质的45-;(3)溶菌酶,分子量25000,约占可溶性蛋白质的20-;及纤维素酶等不同的酶。

名称

木瓜蛋白酶

别名

木瓜酶、番木瓜酶

英文名

Papain

法定编码

EC 3.4.22.2;CAS[9001-73-4]

木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末,微有吸湿性;木瓜蛋白酶溶于水和甘油,水溶液为无色或淡黄色,有时呈乳白色;几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性,有较广泛的特异性,对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力,但几乎不能分解蛋白胨。 [2]

木瓜蛋白酶的最适合PH值6~7(一般3~9.5皆可),在中性或偏酸性时亦有作用,等电点(pI)为8.75;木瓜蛋白酶的最适合温度55~65℃(一般10~85℃皆可),耐热性强,在90℃时也不会完全失活;受氧化剂抑制,还原性物质激活。

木瓜蛋白酶的剪切肽键的机制包括:在His-159作用下Cys-25去质子化,而Asn-158能够帮助His-159的咪唑环的摆放,使得去质子化可以发生;然后Cys-25亲核攻击肽主链上的羰基碳,并与之共价连接形成酰基-酶中间体;接着酶与一个水分子作用,发生去酰基化,并释放肽链的羰基末端。 [2]

《GB 2760-2011 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定,木瓜蛋白酶可用作食品工业在的加工助剂(酶制剂)。一般应在制成最后成品之前除去(规定有残留量者除外)。 [3]

木瓜蛋白酶主要用于啤酒抗寒(水解啤酒中的蛋白质,避免冷藏后引起的浑浊)、肉类软化(水解肌肉蛋白和胶原蛋白,使肉类软化)、谷类预煮的准备、水解蛋白质和肉类香料的生产。在啤酒抗寒和肉类软化方面的应用远比其他蛋白酶类广泛。用量一般为1~4mg/kg促使饼干中面筋的分解,以使成品松软。肉类软化有多种蛋白酶可用,比较如下表所列。 [2]

酶名称

嫩化肉所需酶量/(酶单位/克肉)

木瓜蛋白酶

2.5

菠萝蛋白酶

5.0

无花果蛋白酶

5.0

枯草杆菌中性蛋白酶

75

米曲霉蛋白酶

100

黑曲霉蛋白酶

200

根霉蛋白酶

250

通过测定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力大小,可判断嫩肉粉质量优劣的参考依据:把嫩肉粉溶于盐酸半胱氨酸溶液,取该混合液与酪蛋白溶液反应10min,用紫外分光光度法测得反应所生成酪氨酸的含量。该方法具有较好的准确性和重现性。以每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需样品的量为1个酶活力单位。 [2]

在中国,木瓜种植主要分布在广西的横县和邕宁县等地,属于广西特产水果,因此,木瓜蛋白酶生产厂家主要集中在广西南宁市,木瓜蛋白酶的生产和研究有将近20年的时间。

由木瓜的未成熟果实,经提取乳液、凝固、沉降、干燥而成粗制品。一般工业上以粗制品的应用为主。木瓜蛋白酶韵生产方法有三种,分别是直接热风烘干法、喷雾干燥法及膜分离冻干法。 [2]

生产方法较简单、快速,但生产出来的成品只是粗酶,杂质多、色泽差且微生物超标,酶活力也较低,只有60万~80万单位/g。多为个体工厂采用,已不能满足国内食品质量卫生安全等。

此法是先通过离心去除部分杂质后再进行喷雾干燥,所生产出的成品酶活力相对高,达到100万单位/g左右,杂质相对也较少,色泽相对也较白。但产品喷雾时容易粘壁,酶活损失较大,水溶性相对也较差,而且酶活稳定性也较差。

该生产方法不但避免了以上两种方法的缺点,且生产过程卫生安全,收率也高,所生产的成品酶活损失小,酶活力一般可达到280万~350万单位/g,最高可达400万单位/g,且酶活稳定性好,纯度高,色泽洁白,细菌数低,严格操作可达到医药级别。

其提取工艺条件为超声波功率300W,超声处理时间200s,果浆质量分数30-;经超声波强化提取,酶活力提高到原先的1.71倍;该酶在40℃以下,pH为5.4~6.0时酶活力相对稳定;EDTA、Cys和维生素C对酶活力具有激活作用,CuS04和ZnCl2具有抑制作用,而KCl、NaCI、CaCl2、MgS04对酶活力的影响不大。

木瓜蛋白酶的分离纯化工艺:采用初步采集处理,20-、40-硫酸铵分级沉淀、SP-sephadexC50柱色谱、羟基磷灰石柱色谱,从番木瓜乳汁中分离纯化木瓜蛋白酶。可获得比活为1184U/mg的纯酶,活力回收率为55.79-,纯度达到99.31-,为高纯度的木瓜蛋白酶。

本方法仅适用于木瓜蛋白酶。 [2]

木瓜蛋白酶能使N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(底物)水解而释出N-苯甲酰-L-精氨酸,其释出量可用氢氧化钠液滴定,以此确定酶活力。

在25℃下,每分钟内能催化分解1umol底物的酶量,称为1单位。

1、底物溶液:准确称取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐1.42g,加10mmol/LEDTA、50mmol/L半胱氨酸液2.6mL,加适量水,用0.1mol/L氢氧化钠液调节pH至6.2,最后定容至50.0mL。

2、待测酶液:取试样用水稀释至适当浓度,并调节至pH6.2。

25℃恒温条件下,取25mL烧杯装在pH自动滴定仪上,加底物溶液3.75mL、3mol/L氯化钠溶液2.50mL、重蒸馏水1.25mL,混合后加入待测酶液后立即计时,用0.1mol/L氢氧化钠在电磁搅拌下连续滴定以保持pH6.2,记下每分钟所耗0.01mol/L氢氧化钠毫升数。同时进行空白校正。按下式计算木瓜蛋白酶的活力P(单位/mg):

P =CΔV1000/W

式中:c:氢氧化钠液的浓度,mol/L;ΔV:每分钟消耗氢氧化钠液的体积减去空白值;W:反应液中木瓜蛋白酶的质量,mg。

木瓜蛋白酶在医药、食品、饮料、化学试剂、饲料、纺织化妆品等方面都有广泛的应用,开发前景广阔。

在食品行业中,木瓜蛋白酶可用于肉类嫩化、啤酒澄清、饼干松化等用途。 [4]

啤酒澄清剂

引起啤酒冷藏混浊时主要原因是啤酒中的蛋白质极易与多元酚结合成大分子的复合物。利用啤酒澄清剂中的木瓜蛋白酶对形成混浊的蛋白质有广泛的特异性,能把大分子的蛋白质降解成小分子的物质,提高了蛋白质与多元酚复合物的溶解度;另一方面,木瓜蛋白酶是一种具有生物活性的蛋白质,该蛋白质可与引起啤酒冷藏混浊的多元酚形成稳定状态平衡,防止了啤酒的冷藏混浊。

肉类嫩化剂

利用木瓜蛋白酶能裂解肉类中的胶原蛋白和肌肉纤维,而使肉的结构松散。由于木瓜蛋白酶是半胱氨酰基蛋白酶,能降解胶原纤维和结缔组织蛋白质,它将肌动球蛋白和胶原蛋白降解成为小分子的多肽甚至氨基酸, 令肌肉肌丝和筋腰丝断裂, 使肉类变得嫩滑,并简化蛋白质结构使人体食用后易于消化吸收。

饼干松化剂

利用木瓜蛋白酶的酶促反应, 将面团的蛋白质降解为小分子的肤或氨基酶, 降低了面团的拉伸阻力, 使面团变得柔软、更有可塑性, 减少弹性, 易于成型。用量视饼干厂的加工方法和面团中蛋白质的含量不同而不同,研究表明每公斤面添加0.6-1.0万单位/ 克为佳。

木瓜蛋白酶可用于细胞培养实验,在准备细胞培养液(cellculture)的第一步中被用于分离细胞。用酶处理小组织块10分钟后,就可以将连接细胞的细胞外基质打断;然后再用蛋白酶抑制剂来停止反应,防止木瓜蛋白酶进一步裂解细胞本身;最后用Pasteurpipette将组织块打散为单细胞悬浮液。

在免疫学中,木瓜蛋白酶可被用于将免疫球蛋白(即抗体)的Fc片段(可结晶)和Fab片段(抗原结合)切割开。

S22 Do not breathe dust.

切勿吸入粉尘。

S24 Avoid contact with skin.

避免皮肤接触。

S26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.

不慎与眼睛接触后,请立即用大量清水冲洗并征求医生意见。

S36/37 Wear suitable protective clothing and gloves.

穿戴适当的防护服和手套。

R36/37/38 Irritating to eyes, respiratory system and skin.

刺激眼睛、呼吸系统和皮肤。

R42 May cause sensitization by inhalation.

吸入可能致敏。

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