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拟南芥

拟南芥 (Arabidopsis thaliana)又名鼠耳芥,阿拉伯芥,阿拉伯草。属被子植物门,双子叶植物纲十字花科植物,其基因组大约为12500万碱基对和5对染色体,是目前已知高等植物基因组中第二小的,最小为丝叶狸藻。是一种应用广泛的生物。

一年生细弱草本,高20-35厘米,被单毛与分枝毛。茎不分枝或自中上部分枝,下部有时为淡紫白色,茎上常有纵槽,上部无毛,下部被单毛,偶杂有2叉毛。基生叶莲座状,倒卵形或匙形,长1-5厘米,宽3-15毫米,顶端钝圆或略急尖,基部渐窄成柄,边缘有少数不明显的齿,两面均有2-3叉毛;茎生叶无柄,披针形,条形、长圆形或椭圆形,长5-15 (-50) 毫米,宽1-2 (-10) 毫米。花序为疏松的总状花序,结果时可伸长达20厘米;萼片长圆卵形,长约1.5毫米,顶端钝、外轮的基部成囊状,外面无毛或有少数单毛;花瓣白色,长圆条形,长2-3毫米,先端钝圆,基部线形。角果长10-14毫米,宽不到1毫米,果瓣两端钝或钝圆,有1中脉与稀疏的网状脉,多为桔黄色或淡紫色;果梗伸展,长3-6毫米。种子每室1行,种子卵形、小、红褐色。花期4-6月。 我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有发现。拟南芥的优点是植株小、结子多。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中第二小的。拟南芥是自花受粉植物,基因高度纯合,用理化因素处理突变率很高,容易获得各种代谢功能的缺陷型。

全球除少量地区外均广泛分布

由于有上述这些优点,所以拟南芥是进行遗传学研究的好材料,被科学家誉为“植物中的果蝇”。

1.1 播种和发芽

拟南芥可在非无菌条件下,生长在土壤或人工配制的各种培养基中。作为栽植的容器,可根据各自条件置于花盆或格状分离的多穴塑料盘中。常用的混合物有泥炭藓营养土蛭石珍珠岩等,例如珍珠 岩∶蛭石∶泥炭藓 =1∶1∶1的混合物,表土:堆肥或腐殖质土∶珍珠岩或蛭石 =1∶1,1∶2或 2∶1的混合物。如果用于营养研究则可以蛭石类惰性物质作培养介质,施以配有营养物质的水溶液。栽培拟南芥的介质均要求有良好的排水性,因此一般混合砂子、蛭石等惰性介质,保持良好的排水,防止过湿引起真菌和昆虫幼虫滋生。播种前土壤混合物进行高压灭菌处理 30min,以杀死可能存在于混合物中的任何害虫。在把土壤混合物置于花盆或其他容器中后,将整个容器置于水或营养液中,靠毛细管作用浸湿介质,然后将处理洗净来的种子,用尖头烧融后的移液管小心移至土表,均匀播下。如果播种量较大,可用浓度为 0.1g/100mL琼脂或砂子事先均匀混合后播种。种子发芽期间必须保持高湿度,故容器可用塑料膜覆盖,保持一周左右方可揭去。

将播有种子的容器移至低温或相应低温条件下,在 2~4℃下 放置 2~4d,从而于吸胀条件下破除种子休眠,这对新鲜收获的拟南芥种子尤为必要。对大多数拟南芥品系来说其种子是中度休眠 的,收获已久的这类生态型的拟南芥种子可免于低温处理,而有些生态型甚至需长达7d的 低温 处理。干种子的低温处理往往是无效的。

低温处理后,将盆移至温室或生长室,在 22℃ 左右发芽,夜温可比日温低2℃,用 2000lx的荧光灯给予光照,光周期为18h光 /6h暗(也可24h光照 ),在 5d左右可见拟南芥发芽。拟南芥发芽需光,故防止种子被土覆盖。

1.2 生长发育条件的控制

拟南芥一般是冬性一年生植物,自然条件下种子在秋 天发芽,幼年期度 过冬天,花分生组织在春季分化,种子在夏季成熟脱落。大多数实验室栽植的拟南芥品种在发芽后 4周开花,而在 4~6周后采集种子。不同拟南芥生态型其发育进程快慢、开花时间早晚、何时成熟等除了取决于遗传性以外,也受外界环境条件的影响。

1.2.1 光

光对拟南芥生长的影响涉及光强和光周期两个方面。以光强度说,在生长室中一般最适光的光强度为120~150μmol/( s)(1μmol/( s)=5烛光 =0.217W/m 2 =53.8lx),这可通过荧光灯,配以白炽光来达到。在 夏天温室中,60-荫影有助于光强控制和温度调节,高光强或直接太阳光照射对较老植株可以忍受,而年幼植株避免强光。

拟南芥在连续照光和 长日下开花加快,短日时开花被 阻遏或延迟,这表 明拟南芥开花需要长日照光周期,一般至少12h的光照。在冬季温室中可补充早晚的光照,以满足光周期需要,一般给以16h光照,8h暗期为宜。连续光照可促进生殖循环,略微提早开花,但使叶数减少及降低种生成,而较短日照有利于营养生长。

1.2.2 温度

温室和生长室的温度应予以控制,最适生长温度 为25℃ 左右,稍低的温度也是允许的。当水分供应充足时,植物甚至能在高达34℃ 时生长,但会减少受精。较老的植物能忍受高温,但保持25℃对整个生长周期是有利的。当种子形成时,生长室温度宜设 定在25℃,而温室温度宜在23℃,夜温可比日温低2~4℃为宜。

对于许多迟开花的拟南芥生态型来说,幼苗期要给以 4℃左 右处 理一 个时期(如几周),以完成春化作用,从而在长日下促进开花。而对于常用的拟南芥生态型 Landsbergerecta和 Columbia则 不需作春化处理就能 开花。 必须注意这里的低温春化处理是不同于播种时破除休眠的低温处理,破除休眠的低温处理又称层积处理(stratification)。

1.2.3 水分

在种子发芽后的头几周里,理想的供水是来自毛细管由下至上的渗水,只有当土壤呈现干旱时适时灌溉。过量供水会引起土表藻类和真菌的生长。在拟南芥头两片真叶开始伸展之前必须避免干旱,当真叶长出后,灌水频率可相应减少,如每周一或两次,而至长角果充实阶段必须保证水分供应,以利于种子形成。浇水时最好待90-左右的穴盘或花盆完全干燥之后进行。 不仅土壤供水状况影响到拟南芥的生长发育,而且湿度也会影响水分供给。虽然湿度的增加(如 50- ~60-)会大大减少土表干旱的影响以及发芽着的幼苗脱水危害,但一般说来拟南芥植株,包括幼苗都能忍受低湿度,处在莲座状阶段的植株可在不同湿度下生长,当长角果进入成熟阶段时,较低湿度(如 <50-)是有利的。

1.2.4 营养

正常情况下只要配置合适的土壤混合物,并非必须供给营养物质,但是贫瘠的营养状况会降低植株高度,使它提早开花,并使种子着生减少。在生长发育的后期阶段补充营养物质将会增 加种子着生,并产生较健壮的植 株。当植株呈现出轻微淡绿色时,表明营养供给不 足,则应立即施以营养物质,正常健壮的拟南芥植株是亮暗绿色的。

1.2.5 防止杂交

拟南芥是自交授粉的,为了保持拟南芥品系的纯化,必须防止温室或生长室中各品系之间的杂交。为此可根 据各自实验室条件进行设置。例如,保持生长环境的清洁,从而防止经昆虫载体而导致的杂交机会。栽植时注意各品系种植之间的距离(如 20cm),从而防止来自不同品系的花互相接触。在长成植株后,可采取适当措施,防止植株倒伏,以致互相接触。

拟南芥之所以作为模式植物,其中一个原因 在于可以在培养皿灭菌条件下进行突变体筛选。此外,在许多拟南芥研究方面也需要做无菌培养。无菌培养在拟南芥研究中的应用可归纳为以下几方面:

(1)有利于突变体筛选  突变体筛选是遗传和分子研究中十分重 要的手段,用无菌培养来筛选突变体有许多有利之处。首先,对大量拟南芥诱变处理的种子很容易进行生活力记录。其次,生长在培养皿中的植物可在人工控制的条件下稳定生长,以致使实验设计得以实现,这种突变体筛选方法十分类似于微生物突变体筛选的操作。例如对一些特殊化合物、除草剂、生长调节剂的敏感性可在同一野生型生长阻遏的背景下进行筛选,而如果在土壤条件下对这些化合物进行测试,则很难达到一致的生长 条件,会受到各种因 素影响。再次,无菌培养下培养皿中的筛选还可在下一代同样条件下重新测试和进行遗传分析。

(2)在分子水平分析时,常需经基因工程的方法 取得转 基因植物,而转基因植物获得过程中,常采用抗生素筛选等手段,这就必须将 抗生素置于培养基中,在无菌条件下,使转化有外源基因的个体存活,而淘汰未转化的组织。

(3)一些实验操作过程中,为达到某种目的,必须进行无菌培养,例如在用无菌或无真菌的组织进行组织培养,种子发芽测试等。

(4)一些突变体由于缺少了或降低了对生长调节剂的敏感性,或 者缺少了特殊代谢途径中的某个基因,而 生长十分弱时,必须在特殊培养基上发 芽和生长,然后才转入土壤中继续生长。

2.1 无菌培养的培养基组成

最普遍的培养基是1倍或0.5倍浓度MS培养基,其中加入琼脂达 0.6- ~0.8-的浓度,可另加蔗糖至 0- ~3-。也有实验采用 GamborgB5培养基。以下列出一种培养基配方:

培养基组成 最终浓度

MS基本培养基盐类 4.4mg/mL

蔗糖 10mg/mL

肌醇 100μg/mL

硫胺素 1.0μg/mL

吡哆醇0.5μg/mL

烟酸 0.5μg/mL

MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸] 0.5mg/mL

在上述配制溶液中,加入 1mol/LKOH调 pH至 5.7,在加入适量琼脂或蔗糖后,灭菌,贮存。当需铺平板时,将贮藏培养基置于微波炉中熔化,即可将其倒至培养皿中。0.8-琼脂浓度有利于在不伤根的情况下取出培养的小植株,并移植至土壤。蔗糖用作碳源,有利幼苗茁壮生长,但对只需短时间发芽生长的处理可免去蔗糖成分。

2.2 种子灭菌和播种

种子表面灭菌可采用漂白剂、乙醇等,另可附加 SDS,TritonX-100等。例如,将拟南芥种子用含 0.001- ~0.2- SDS的 50-漂白剂处理 10min,或 者将种子在 50-乙醇中浸润1min再用漂白粉处理。其中SDS也可用 0.1- TritonX-100代替,最终用无菌水淋洗晾干。如果灭菌过程不采用漂白粉,可将种子在50-乙醇和 0.5- Triton中放置 3min,再用 95-乙醇淋洗,并令其快速风干。

作为模式植物栽培时,为了使植株正常生长,培养出有代表性的群体以及潜在的新突变体在早期筛选过程中不致因病虫害侵袭而使 表型丢失,因此必须注意病虫害防治。只要采取适当的措施,温室或生长室的病虫害是可以预防的。病虫害可能来自土壤,种子或操作人员本身。防治的原则应以防为主,杀灭为辅。最积极的措施是保持培养环境的清洁。

常见拟南芥病虫害及一般症状

1.虫害

1.1 蚜虫(aphid)

蚜虫聚集在叶和花 茎上,在茎、叶上分泌密 露,咬食幼小组织致使叶扭曲,严重时可引起萎蔫甚至死亡。

1.2 蓟马(thrip)

叶上呈现银色或白色斑点,此蓟马科害虫在花序上积聚,并使受精受阻。

1.3 蘑菇蝇(mushroom fly)

在地上部未有明显伤害情况下植株长势弱,叶变黄,在根组织上可见到灰白的蛆,蛆在根上觅食。成年蝇聚集在植株周围,有时以蝇斑呈现。

1.4 红蜘蛛(redspidermite)

在干、热条件下易侵染,叶被造成银色斑点,严重时植株变黄,萎蔫。叶下表面被细白丝线悬浮的白粉蒙盖。

1.5 白蝇(whitefly)

在叶下表面呈现,成 虫是 小白蝇。若 虫为浅绿色。它通过吸食汁液侵害植物,侵染导致植株长势减弱,萎蔫,死亡。

2.病害

2.1 白粉病(powderymildew)

在叶花茎、长角果上呈现白粉斑,严重时会造成植株萎蔫,死亡。

2.2 灰霉病(botrytis)

灰色毛状霉菌呈现在植株表面,叶随之腐烂,有时可能伴随物质的降解。

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