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工具酶

基因工程的关键技术是脱氧核糖核酸的连接和重组,在此过程中一些酶起着至关重要的作用,这些酶统称为基因工程工具酶。工具酶种类繁多、功能各异,主要包括限制酶、聚合酶、连接酶、修饰酶和核酸酶五大类。其中,以限制性核酸内切酶DNA连接酶分子克隆中的作用最为突出。这些酶具有特异性的序列识别能力以及高效的生物催化活性,在一定的条件下可以对核酸分子进行切割、连接、扩增以及修饰等,同时工具酶的反应条件温和且具有出色的生物相容性。基于这些优势,工具酶被广泛地应用于核酸、蛋白质和小分子等生物活性分子的分析检测。

1、DNA限制性内切酶

生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶,即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的,故名限制性内切酶(简称限制酶)

限制性内切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA内切酶之分,Ⅱ型能严格识别核酸序列,并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA内切酶。识别分四核苷酸,五核苷酸,八核苷酸和六核苷酸,其中以六核苷酸为主,其序列旋转对称。切口分黏性末端和平末端,产生3′-OH和5′-P末端。内切酶品种多,使用时应注意温度、缓冲液用量(一般1μg DNA/2-5单位酶)等反应条件。

2、连接酶

它是一种封闭DNA链上缺口酶,借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外),而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

连接酶T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希菌DNA连接酶等。DNA连接酶可连接平端,也连接粘端。反应需有Mg2+和ATP存在,pH7.5-7.6。最适温度37℃,30℃以下活性明显下降,但考虑到被连接DNa 的稳定性和粘性末端退火温度,一般平端连接用20-25℃,粘端连接用12℃左右。

聚合酶有DNA聚合酶(以DNA为模板合成DNA大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ,大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow大片段),T4或T7噬菌体DNA聚合酶等);RNA聚合酶(以DNA为模板合成RNA,T7或T3噬菌体RNA聚合酶);逆转录酶(以RNA为模板合成DNA,除RNA病毒中发现外,发现大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆转录活性)。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′,3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段,有5′→3′聚合酶和3′→5′外切酶活性,无5′→3′外切酶活性。可用于缺口翻译(Nick translation)法标记核酸,也可用于DNA序列测定,修补DNA链等。

3、聚合酶

又称DNA聚合酶。系专司生物催化合成脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的一类酶的统称。

可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶;(2)依赖RNA的DNA聚合酶;(3)依赖DNA的RNA聚合酶;(4)依赖RNA的RNA聚合酶。前两者是DNA聚合酶,它使DNA复制链按模板顺序延长。如在原核生物中仅就大肠杆菌中已被发现的就有三种(分别简称为P01Ⅰ,P01Ⅱ和P01Ⅲ等);DNA聚合酶只能在有引物的基础上,即在DNA或RNA引物的3′-OH延伸,这DNA的合成方向记为5′→3′。换言之DNA聚合酶催化反应除底物(αNTP)外,还需要Mg2+、模板DNA和引物,迄今细胞内尚无发现可从单体起始DNA的合成。同样,上述(3)和(4)是催化RNA生物合成反应中最主要的RNA合成酶,它们以四种三磷酸核糖核苷(NTP)为底物,并需有DNA模板以及Mn2+及Mg2+的存在下,在前一个核苷酸3′-OH与下一个核苷酸的5′-P聚合形成3′,5′-磷酸二酯键,其新生链的方向也是5′→3′。RNA聚合酶也大量存在于原核和真核生物的细胞中。如大肠杆菌RNA聚合酶分子量4.8×105,由5条多肽链组成,分别命名为α,α,β,β′,和γ,全酶可用α2ββ′λ表示。真核生物RNA聚合酶分子大于5×105,由10~12个大小不等亚基组成。聚合酶除作为自然界生命活动中不可缺少的组分外,在实验室中大多用作生命科学研究的工具酶类之一。

4、核酸酶

核酸酶DNaseRNase、核酸酶S1等,可水解相应的DNA和RNA,核酸酶S1可降解单链DNA和RNA,用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环

末端转移酶在Mg2+存在下,选择3′-OH端单链DNA为引物加成核苷酸,在Co2+存在下,选择3′-OH端双链DNA为引物加成核苷酸,形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端标记和核酸连接的互补多聚尾(连接器)。

5、修饰酶

体内有些酶可在其他酶的作用下,将酶的结构进行共价修饰,使该酶活性发生改变,这种调节称为共价修饰调节(covalent modification regulation),这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)。

碱性磷酸酶去除5′-P,可防止二分子DNA片段5′端P基团自身空间障碍,影响DNA分子之间的连接,一般用碱性磷酸酶处理载体DNA除去5′端P基团,在连接酶作用下目的基因的5′端P先与载体3′端OH连接,再通过复制修复另一条链,使二条链完全连接。该方法大大提高了连接效率。

1、核酸检测

核酸酶是一类对底物核酸具有切刻或者连续消化能力的蛋白酶,自20世纪60年代以来,它常作为一种模型蛋白被广泛应用于分子生物学的研究中。核酸酶的作用方式和底物特异性都随着来源的不同而存在差异,根据核酸酶作用位置的不同,将其分为限制性内切酶和核酸外切酶两种。大多数限制性内切酶可以识别含有回文序列的双链DNA,并对其两条核酸链均进行切割。同时,限制性核酸内切酶中还有一类特殊的酶称为切刻内切酶,这类酶只能在特定的酶切位点上对双链DNA中的一条链进行酶切水解作用,最终造成一个切口而不是切断。利用切刻内切酶的这个特殊性质来切割信号探针并反复循环使用靶核酸链,可以实现检测信号的循环放大,已被广泛地应用于构建核酸或其它相关靶分子的生物传感器。

核酸外切酶可以沿着核酸链末端依次水解作为核酸骨架的磷酸二酯键并生成单核苷酸。依据作用底物单双链的区别,可将核酸外切酶分成两类,对单链具有特异性水解能力的核酸外切酶,如大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅶ,以及能特异性水解双链的核酸外切酶,如大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ和λ-噬菌体核酸外切酶等。这些酶中还可以根据酶切起点基于微阵列上RNA探针选择性水解的信号放大技术原理的不同,分为从分子链的3′末端或5′末端开始切断的酶。核酸外切酶Ⅲ作用双链DNA时,沿着3′→5′方向逐步催化去除单核苷酸,没有特异性的结合位点,但是对双链DNA的3′端突出末端和单链不发生水解作用。利用核酸外切酶Ⅲ特异性剪切水解互补3′端的这个特性,在目标物存在时,可将信号分子如染料分子与其猝灭剂分离,恢复荧光信号。进一步循环使用目标物,可放大核酸信号,提高检测灵敏度。随着荧光分析的快速发展,大量猝灭剂被应用到基于核酸外切酶Ⅲ的信号放大方法中,如猝灭基团、氧化石墨烯、单壁碳纳米管、钯纳米线等。除了使用猝灭回升的信号生成手段,还有核酸外切酶Ⅲ参与量子点-染料荧光共振能量转移信号放大方法。此外,比色信号、化学发光信号和电化学信号等被引入核酸外切酶参与的信号放大检测方法,很大程度上拓展了核酸外切酶的应用范围。另外,科学家将核酸外切酶Ⅲ辅助的靶核酸循环放大技术与流式细胞仪微球相结合,构建了一个快速、可再生的高通量多元核酸同时检测平台。相比传统的流式细胞仪微球方法,灵敏度提高58.6-。

2、蛋白质及小分子检测

1990年,科学家利用SELEX技术成功筛选出了聚合酶的寡核苷酸,为其命名核酸适配体,从此开启了核酸适配体研究的新时代。核酸适配体是一段能结合不同靶分子的DNA或者RNA序列,它们之间的这种结合能力具有高度特异性和亲合力。利用核酸适配体作为转换器,可以实现核酸检测与蛋白质及小分子检测之间轻松的转换,从而将核酸工具酶参与的信号放大方法灵活地应用到蛋白及小分子的检测当中。与核酸检测类似,有学者将分子信标上修饰有荧光基团的茎延长,组成一段血小板源生长因子BB的适配子序列。与靶蛋白PDGF-BB结合后,分子信标的二级结构发生改变,引物链结合上去,启动了聚合酶的扩增反应。反应过程中,在形成一条完全互补的DNA双链的同时,改变了适配子的二级结构,靶蛋白脱离出来,进入靶分子循环置换聚合反应,实现靶分子的放大检 测。为了进一步降低体系的背景,获得更高的灵敏度,引入氧化石墨烯作为猝灭剂,实现γ-干扰素的高灵敏检测。除了通过与靶分子结合后探针二级结构改变,暴露出引物链的结合序列,触发酶的复制聚合反应,还可以利用核酸适配子与靶分子的高亲和性,竞争出游离的引物链,在模板链和聚合酶的作用下,启动滚环扩增反应,实现靶分子的放大检测。

3、多重放大技术

为了获得更高的检测灵敏度,将多种信号放大技术结合起来使用是一种有效途径。基于切刻内切酶与DNA聚合酶组合作用的等温循环链置换放大技术,是近年来被广泛使用的一种工具酶组合信号放大技术。该技术的基本原理是:通过碱基的互补配对杂交形成切刻内切酶的识别位点后,切刻内切酶在该位点对其中的一条核酸链进行切刻作用产生3′端为羟基的切口。聚合酶识别该切口的3′端,以未切割的序列为模板,沿着3′到5′的方向复制聚合置换被切割链的另一段序列,最后形成一条完整的双链结构。形成的双链DNA再次被切刻内切酶识别剪切,启动聚合酶反应。如此“切刻-聚合-置换”的不断循环,得到大量单链核酸结构,从而实现核酸链的扩增与信号放大的目的。由于操作简单、扩增效果显著,切刻内切酶与DNA聚合酶组合使用的多重放大技术受到很多生化分析科研工作者的青睐。利用该放大技术,科学家设计了一种基于切刻内切酶和DNA聚合酶组合的DNA机器,并将其用于核酸的放大检测。目标核酸链作为DNA机器的“运转轨道”,与引物结合后,作为模板链启动DNA聚合反应,形成完整的双链DNA。复制扩增出的核酸链被切刻内切酶剪切形成切口,在聚合酶的作用下从“运转轨道”上置换下来,结合有引物链的目标核酸链,进入“聚合-置换-切刻”的循环过程,利用DNA机器的运转,产生大量核酸单链,最终导致纳米金的聚集产生比色信号。

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