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基因转移

基因转移泛指基因或DNA片段在不同生物个体之间的传递,包括横向和纵向两个方向。纵向传递即通过繁殖进行的亲代和子代基因传递,基因横向传递:水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT),又称侧向基因转移(lateral gene transfer, LGT),是指在差异生物个体之间,或单个细胞内部细胞器之间所进行的遗传物质的交流。

最常用的将克隆重组的DNA片段导入哺乳动物细胞的方法是用磷酸钙介导的转染。转染的DNA可能是通过吞饮作用进入细胞质,然后进行细胞核。

基因转移是用物理的、化学的或生物学的方法将目的基因导入受体细胞并使之表达的一种技术。

包括显微镜注射法、电脉冲介导法。显微注射法是应用特别的玻璃显微注射器在显微镜下把重组DNA导入靶细胞;电脉冲介导法又称电穿孔法,是指在高压电脉冲的作用下,使细胞膜上出现瞬间微小的孔洞,从而介导不同细胞之间的原生质膜发生融合,使外源DNA通过细膜上出现的瞬间小孔而进入细胞。

有DNA-阳离子-二甲基亚砜法。基因转移的生物学方法包括细胞融合法、脂质体介导法、原生质体融合法等。除以上三种方法外,又出现了颗粒轰击技术,就是将外源DNA包被在金属上,在电场中包被DNA的金属颗粒获得能量并以高速度运动,穿入靶细胞组织或器官内,由于这种金属颗粒可以涂成薄膜状,所以可实现较多细胞的基因转移同时发生,改进了其它物理方法基因转移效率低的缺点。

尽管物理法、化学法及生物学法在基因转移中被广泛应用,但由于基因转移效率较低,在短时间内难以取得基因治疗所需要的108~1012个转化细胞,因而在基因治疗的应用中仍然具有一定局限性,虽然对其进行了一些改造,如颗粒轰击技术的处理和应用,但也不能完全克服以上缺点,故而在基因治疗中不得不救助于其它技术,目前被广泛应用的一种技术就是逆转病毒载体技术(RMGT)。

是目前将外源基因导入细胞的最有效的方法。此系统包括重组逆转录病毒载体和包装细胞两个部分,广泛应用的逆病毒载体LNL6是以Moloney鼠白血病病毒(MO-MLV)改建的。该病毒为RNA病毒,感染细胞后,其基因组RNA经逆转产生双链DNA拷贝插入宿主染色体形成前病毒,前病毒转录产生正链即为病毒基因组RNA。整个基因组从5′端到3′端依次是:5′长末端重复顺序(LTR)编码病毒内部结构蛋白的gag基因,编码蛋白的pol基因,编码外壳蛋白的env基因以及3′LTR和一个介子5′LTR和gag基因之间的包装信号。将病毒蛋白编码区gag、pol、env全部切除,代之以外源性目的基因即改建为病毒载体,保留了LTR和包装信号,是一种复制缺陷性病毒。同时,设计一种包装细胞系,其内含有辅助病毒基因组,即为包装信号缺乏的MO-MLV。当逆转录病毒载体进入包装细胞系时,载体基因就被包装形成完整的病毒颗粒,于是包装细胞系就成了制造病毒载体的生产细胞系。将靶细胞与生产细胞系其同培养或是收集含有载体病毒的生产细胞系上清液与靶细胞一起孵育,即可有效地进行基因转移。逆转录病毒载体技术的优点在于转染谱广,可感染包括人体在内的多种动物细胞类型,一次可感染大量细胞,转染率高达100-,转染的基因可为单拷贝和少数拷贝,能准确地整合到宿主细胞基因组中,整合率高,且能长期有效地表达。

载体的滴度较低;

②是辅助病毒载体病毒重组重新获得包装信号使病人面临感染辅助病毒的危险性;

③此载体只能整合至分裂相细胞;

④此载体容纳的外源基因量较少,不利于较大的基因的插入。

因此,人们在努力改造包装细胞系使其日趋完善,并广泛用于体外及体内的基因治疗中。在体外治疗中,为了增强肿瘤病人骨髓细胞对化疗药物的敏感性,将骨髓细胞和带有mdrI基因的逆转录病毒在体外共同培养后回输体内,获得了很高的疗效;在体内治疗中,用HSV-tk基因构建的逆转录病毒感染成纤维细胞后被直接注入鼠脑神经胶质瘤细胞中,再给予GCV治疗,转染了HSV-TK基因的胶质瘤细胞对GCV的易感性使得肿瘤完全消退了,目前,这项实验的临床应用阶段尚未报道。

(1)配制下列溶液

①2×HEPES-缓冲盐溶液(HBS)

②2mol/L CaCl2

③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm滤器过滤除菌,分装贮存于4℃。

④DNA:将DNA(约20μg/106细胞)溶于0.1×TE(pH8.0),使用浓度为40μg/ml。为使转化效率达到最高,质粒DNA应用CsCl-溴化乙锭密度梯度平衡离心法纯化。如果所用DNA量较少,应加入载体DNA将DNA浓度调至40μg/ml。实验室制备的真核载体DNA转染效率通常要比商品化的牛胸腺DNA、鲑鱼精DNA高。载体DNA用前应通过乙醇沉淀或氯仿抽提进行灭菌。

(2)转染前24h用胰蛋白酶进行消化以获得对数生长期的细胞,以1~2×105细胞/cm2的密度重新种入60mm组织培养皿中。在37℃、5-~7-CO2及一定湿度的培养箱中培养20~24h。

(3)每转染一个60mm培养皿中的单层细胞,须依如下方法制备磷酸钙-DNA共沉淀物取步骤一所制备的DNA[40μg/ml,溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的灭菌5ml塑料管中,缓慢加入31μl 2mol/l 氯化钙(温和混合30s左右)。于室温育20~30min,其间将形成细小沉淀。温育结束时,用吸管将混合液吹打一次,使沉淀物悬浮。

通常采用的另一方案是将氯化钙和DNA的稀释混合液加入2×HBS溶液中,逐滴加入并小心混合250μl按步骤一制备并溶于氯化钙(250mmol/L)的DNA。按照前述方法温育之。

如果需要转染更为大量的细胞,上述两种反应混合液的体积均可翻一番或翻两番。如果体积翻两番,则须使用更大的塑料管,一般在25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿上,可将0.5ml磷酸钙-DNA共沉淀物加入5ml培养液中,而在90mm细胞培养皿上,一般将1ml沉淀物加入10ml培养液中。

已经发表的方案中,混合各组分的方式与速率大不相同。其中有一些认为除了温和振摇之外,其它措施均无济于事,并建议用电动移液装置吹出的空气来混合溶液。其它一些方案则规劝在加入DNA溶液时连续而缓慢地混匀,然后再温和振荡。其目的是为了避免急速形成粗沉淀物,以致降低转化效率。实际上,除了混合的速度之外,还有其它若干因素包括DNA的浓度和大小(让高分子量DNA从细针头中通过,可将之剪切变小)、缓冲液的精确pH(有些工作者配制了几批pH范围从6.95至7.1不等的HBS缓冲液,逐批试验沉淀物的质量及转染效率)。如果必须使转染效率达到最高,就要花时间针对特定的系统优化上述几种因素。一旦得到一批灵验的试剂,只需依照前面方法进行配制和贮存,即可在长期内获得可重复的结果。

(4)将磷酸钙-DNA悬液转移至细胞单层上的培养液中[在60mm培养皿中,可将0.5ml悬液加入5ml培养液中],轻轻左右晃动一下培养皿使培养液得以混合,此时可见培养液成黄橙色浑浊状。另一方法是吸出培养液,直接把沉淀物加到细胞上,将细胞置于室温温育15min,然后再将培养液加回到培养皿中,此时细胞上有许多细小颗粒。采用以上两种方法,都要在37℃、5-~7-CO2及一定湿度的培养箱中将转染细胞培养长达24h[时间的长短取决于后续处理步骤的不同,见步骤(5)]。

(5)然后,转染细胞可依以下任一种方法处理:

①如果不进行其它处理(如用氯喹、甘油或丁酸钠等试剂处理,见后),可在细胞培养16~24h后,吸出培养液和沉淀物,用PBS将单层细胞再洗一次。然后按下述③d操作。

②在许多情况下,同时用氯喹处理细胞,可提高DNA摄入率。氯喹可能是通过抑制溶酶体水解酶类对DNA的降解而起作用的。氯喹浓度及其处理时间不能超越细胞对其毒性作用的耐受能力。因此必须通过预实验来决定适于所用特定型别细胞的最佳氯喹浓度。但对于大部分型别的细胞,用终浓度为100μmol/L的氯喹处理3~5h,都可取得良好效果。可在磷酸钙-DNA共沉淀物加入细胞之前或之后(见步骤(4)介绍的其它方法),直接将氯喹二磷酸贮存液(过滤除菌并贮于-20℃用金属泊密封的管中,100mmol/L)稀释(1:100)于培养液中。在氯喹处理过程中,细胞呈现泡状是正常的。经用DNA和氯喹处理3~5h后,弃去培养液和沉淀,用PBS洗,然后按下述d操作。

③用甘油短暂处理细胞,同样可提高转化效率或导入DNA的瞬时表达水平。这一步骤可以在氯喹处理之后进行。由于不同细胞对甘油的毒性作用的敏感性相差悬殊,因此每种型别的细胞都必须通过预实验决定最佳处理时间(从30s至3min)。耐受甘油的细胞可以暴露于含磷酸钙-DNA共沉淀物(含或不含氯喹)的生长液3~5h后进行休克。

a. 吸出生长液,用PBS将单层细胞洗1次

b.在单层细胞中加入1.5ml溶于1×HBS的15-甘油,在37℃培养0.5~3min

c.吸出甘油,用PBS将单层细胞洗1次

d.加入5ml预加温的完全生长液,放入培养箱中继续培养24~60h后,检测DNA的瞬时表达或将细胞重新种入适当的选择性培养基中,分离稳定的转化体

④业以表明,丁酸钠也可以在猴源和人源细胞中增强带SV40早期启动子/增强子的重组质粒的表达。可直接在生长液中加入有关试剂,也可以使经过甘油休克的细胞接受丁酸钠处理。须视细胞型别的不同,采用不同浓度的丁酸钠(500mmol/L贮存液,在化学通风橱中用NaOH中和丁酸制备而成),例如:

CV-1 10mmol/L

NIH-3T3 7mmol/L

HelaS3 5mmol/L

CHO  2mmol/L

不加完全生长液,然后重复步骤d。

(6)转移基因表达和细胞集落形成

瞬时表达:在转染后48~60h收获细胞,进行RNA或DNA杂交分析。新合成的蛋白质可以用放射免疫测定Western印迹,体内代谢标记-免疫沉淀或者细胞提取液中酶活性的测定等方法来进行分析,如果测定中有重复品或者转染细胞要经过多种不同条件或在一段时间历程以内取不同时间进行处理,就要避免皿与培养皿之间转染效率的偏差。在这些情况下,最好转染大片的单层细胞(90mm培养皿),培养24h后用胰蛋白酶进行消化,再分接到若干较小的培养皿上。

②稳定转化:在非选择性培养基中培养18~24h,使所转移基因得到表达之后,用胰蛋白酶消化细胞,种入适当的选择性培养基中。这种培养基在2~3周内每2~4d须更换1次,以便除去死细胞残骸并使抗性细胞集落得以生长。

可以克隆单个细胞集落,增殖后进行测定。可以用冰预冷的甲醇将仍保留在培养皿内的细胞固定15min,再于室温用10-Giemsa染色15min,最后用自来水冲洗,这样即可得到细胞集落数的永久记录。Giemsa染液可用PBS或水现用现配,并用Whatman 1号滤纸过滤。

重新接种细胞以便取得分隔良好的细胞集落所要求稀释倍数,主要由稳定转化的效率来决定。这一效率可以相差若干个数量级,它起决于:a.受体细胞的型别(即使同一细胞系,克隆不同或传代数不同,也表现出显著差异);b.导入基因的特性及其转录调控信号强弱;c.转染中所用供体DNA的量。

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