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基因扩增技术

又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍,从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力,能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品,因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点,已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。

PCR技术是由Cetus公司和加利福尼亚大学1985年联合创造的,主要贡献者为Kary B mulis和HeneryA、Erlich。该方法首先被应用于人β-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断。自85年首次报道PCR方法以来,PCR被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变遗传病传染病、性传播性疾病及法医判定和考古研究等多领域、并发挥了越来越大的作用。因而发明人Kary B、mulis获1993年诺贝尔化学奖

PCR扩增DNA的原理是:先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链,然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物,即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段,一般需20-30个碱基对,过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后,以靶DNA单链为模板,经反链杂交复性(退火),在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷(dNTP)为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。

引物在反应中不仅起引导作用,而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列,并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开引物退火复性在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程,使每次循环延伸的模板又增加1倍,亦即扩增DNA产物增加1倍,经反复循环,使靶DNA片段指数性扩增。

PCR的扩增倍数Y=(1+E)n,这里Y是扩增量,n为PCR的循环次数。E为PCR循环扩增效率。设PCR扩增效率E为100-、循环次数n=25次,靶DNA将扩增到33554432个拷贝,即扩增3355万倍:若E为80-、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝,即扩增产物约丢失93-,若E=100-,n=20,则扩增数量减少1048576个拷贝,扩增产物约减少97-。可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。

PCR扩增属于酶促反应,所以,DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升,随着靶DNA片段的逐渐积累,当引物模板/DNA/聚合酶达到一定比值时,酶的促化反应趋于饱和,此时靶DNA产物的浓度不再增加,即出现所谓平台效应。PCR反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶DNA的含量和扩增效率,起始模板量越多到达平台期的时间就越短、扩增效率越高到达平台期的时间也越短。另外酶的含量,dNTp 浓度,非特异性产物的扩增都对到达平台期时间有影响。

首次报导的PCR所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段,其酶活性在90℃会变性失活,需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段,同时引物是在37℃延伸(聚合)易产生模板引物之间的碱基错配、致特异性较差,1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的Taq DNA聚合酶,在热变性处理时不被灭活,不必在每次循环扩增中再加入新酶,可以在较高温度下连续反应,显著地提高PCR产物的特异性,序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。

扩增过程中,单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一,足可以提供特异性分析,选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。PCR能一次确定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。

理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上,实际应用已证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞,或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。

一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增,加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成,不用分离提纯病毒,DNA粗制品及总RNA均可作为反应起始物,可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、活体组织等粗制的DNA的提取液来扩增检测,省去费时繁杂的提纯程序,扩增产物用一般电泳分析即可,不一定用同位素,无放射性易于推广。

扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆,摆脱繁琐的基因方法,可直接从RNA或染色体DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因,省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在PCR引物端事先构建一个内切酶位点,扩增的靶DNA可直接克隆到M13,PUC19等相应酶切位点的载体中。

先按通常方法用寡脱氧胸苷引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA,再将得到的单链cDNA进行PCR扩增,即使mRNA转录片段只有100ngcDNA中的0.01-,也能经PCR扩增1ng有242碱基对长度的特异片段,有些外显子分散在一段很长的DNA中,难以将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作模板,则可将外显子集中,用PCR一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。

(1)引物:决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同,选用不同引物,每种病原微生

物都有自己特异的引物。

(2)耐热的DNA聚合酶:此酶是从耐热细菌中分离出来的,能耐受高温90℃-100℃。

(3)10×PCR缓冲液:500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。

(4)5mmol/L dNTP贮备液:将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并,加入灭菌去离子水溶解,用NaOH调pH至中性,分装每份300μl,-20℃保存。dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。

(5)DNA模板:用处理液将待测标本处理,不同处理方法、操作各异,但目的是暴露标本中被检测的DNA。

过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中,然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下:

(1)向一微量离心管中依次加入

DNA模板  102-105拷贝

引物  各1μmol/L

dNTP    各200μmol/L

10×PCR缓冲液 1/10体积

ddH2O 补到终体积(终体积50μl-100μl)

混匀后,离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用,现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液,引物,ddH2O混合在一起,反应体积为20-25μl,只要试验人员加入处理好的样品就可以了。

(2)加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。置反应管于97℃变性10min。

(3)冷至延伸温度时,加入1-5u Taq DNA聚合酶,离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。

(4)PCR的循环程序为:94℃变性30s,55℃退火20s,然后在72℃延伸30s,共循环30-35次。最后一次循环结束后,再将反应管置72℃温育5min,以确保充分延伸。

PCR尚可用于组织标本DNA的扩增。由于固定组织标本的DNA常发生降解,就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。87年Impraim等人首先将PCR技术引入固定包埋组织内DNA分析。他们先从组织标本中提取DNA,再用PCR进行特异性的DNA扩增,应用这种方法,他们成功地从保存30至40年之久的组织标本DNA中扩增了HPV病毒基因片段。但这种方法需要提取DNA,操作比较繁琐。1988年Shibata等人对Impraim的方法进行了改进。他们将固定包埋的组织块制成5-10um厚,0.4cm大小的切片。将切片放入容积为500μl的Eppendorf管内。加入400μl二甲苯脱脂,离心除去二甲苯,用400μl 95-乙醇洗去残余二甲苯。离心除尽乙醇、加入100μlPCR反应基质,将Eppendorf管放入沸水浴中煮10min,然后按前述PCR方法进行DNA扩增。

在应用PCR方法检测RNA病毒时,首先应将RNA转化成cDNA才能进行扩增,因为PCR只能对DNA模板进行扩增,我们把这种RNA的PCR反应称为反转录PCR,简称RT-PCR。把由RNA转化成DNA的过程叫做反转录,反转录需要在反转录酶的作用下完成。

PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增,处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。采集标本方法不当,未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴性。但是如果待扩增标本中模板DNA浓度太高也会导致扩增失败。

PCR结果的特异性取决于引物的特异性,扩增产物的大小也是由特异引物限定的。因此,引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定性的作用。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析(HPLC)纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”,其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此,PCR所用引物质量要高,且需纯化。冻干引物于-20℃至少保存12-24个月,液体状态于-20℃可保存6个月。引物不用时应存于-20℃保存。

PCR反应中引物的量也影响PCR扩增效果,当PCR引物量太低,则产物量降低,会出现假阴性。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成,还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物,与靶序列竞争DNA聚合酶,dNTP底物,从而使靶序列的扩增量降低。一般认为PCR反应中引物的终浓度为0.2~1μmol/L为宜,但我们实验发现,最适浓度远远低于此浓度。

PCR反应的缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一种双极性离子缓冲液,20℃时其pKa值为8.3,△pKa值为-0.021/℃。因此,20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在实际PCR中,pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力,如将Tris浓度加大到50mmol/L,pH8.9,有时会增加产量。

反应混合液中50mmol/L以内的KCl,pH8.9有利于引物的退火,50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+,其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛血清白蛋白(100μg/ml)或明胶(0.01-)或Tween 20(0.05- ~0.1-)有助于酶的稳定,反应中加入5mmol/l 的二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用,尤其在扩增长片段(此时延伸时间长)时,加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。

Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性,这是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它还影响着引物的退火,模板与PCR产物的解链温度,产物的特异性,引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时,酶活力显著降低;过高时,通常会导致非特异性扩增产物的累积。PCR混合物中的DNA模板,引物和dNTp 的磷酸基团均可与Mg2+结合,降低Mg2+实际浓度。因为Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。

四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)是DNA合成的基本原料,PCR反应中dNTP含量太低,PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合将其错误掺入(即所谓的“热力背信”),因此应当避免。一般认为最适的dNTP浓度为50~200μmol/L。dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。

PCR之所以能得到广泛应用,主要是因为Taq DNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus(Taq)中分离出的热稳定性DNA聚合酶,使用Taq DNA聚合酶不仅简化了PCR程序,也极大地增加了PCR特异性及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高(79℃),使引物在高温下进行退火和延伸,这样便增加了反应的总强度并减少了与错配引物的延伸。在PCR反应中,每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳,酶的浓度太低会使扩增产物产量降低,如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的常见原因。

1.变性温度与时间

PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR产物双链完全解开,才能有效的和引物结合。这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高,时间越长变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响Taq DNA聚合酶的活性,所以通常选用变性温度为95℃30s为宜。在PCR反应中第一个循环变性最重要,需时间较长,因模板DNA的链比较长。

2.复性温度与时间

变性温度是PCR反应成败的关键,复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好,但是容易出现引物与靶DNA的错配,增加非特异性结合,温度太高不利于复性,大多数PCR反应的复性温度在55℃左右。确定了复性温度后,复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。

3.延伸温度与时间

引物延伸温度一般为72℃。这个温度即考虑了Taq DNA聚合酶的活性,又考虑到引物和靶基因的结合。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性,也会影响其产量,72℃时,核苷酸的合成速度为35-100个核苷酸/S,这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而,延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对很低浓度底物的扩增,延伸时间要长些。

4.循环数:

循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下,最适循环数取决于靶序列初始浓度。靶序列的初始浓度较低时、要增加循环次数。另外,酶活性不好,或量不足时也要增加循环次数、以便达到有效的扩增量。

在将Taq DNA聚合酶引入PCR反应,并使之达到自动化之后,PCR反应已变得十分的简单了。但是PCR样品的采集及制备却并非同样简单,而且,许多PCR的失败都归因于标本的制备不当。用于PCR的标本必须经适当处理后才能使用,因为标本中的许多杂质能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外,处理标本可使待扩增DNA暴露,能与引物复性。关于PCR标本制备各种专业书中介绍了许多,我们实验发现操作复杂、不慎便容易造成污染,且不实用。现介绍一种简单快速的处理方法即3-异硫氰酸胍和待检标本混合100℃,10min,离心取上清作为PCR模板即可。

所有实验结果都有成功或失败,实验的失败可能是应该出结果而没有出,我们把它称作假阴性,不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。

出现假阴性结果最常见的原因是:Taq DNA聚合酶活力不够,或活性受到抑制;引物设计不合理;提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当;循环次数不够。所以在实验中出现假阴性失败时,首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循环,一般都会获得成功。如果没有成功应检查PCR扩增仪的温度是否准确,采集标本是否有问题。为了防止假阴性的出现在选用Taq DNA聚合酶时,要注意用活力高质量好的酶。同时在提取PCR模板时,应特别注意防止污染抑制酶活性物质(如酚、氯仿)的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度要求不高,但也不允许有破坏性有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件及特异性是引物与靶DNA良好的互补,尤其是要绝对保证引物的3′端与靶基因的互补。对变异较大的扩增对象,宜采用巢式(Nested)PCR或double PCR。在进行PCR操作时应注意Mg2+的浓度要合理。PCR反应的各温度点的设置要合理。

PCR结果的假阳性是对被检测标本而言,而反应系统中所扩增的产物是真实的。因为PCR技术高度灵敏,极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增,而造成结果判断上的失误,所以污染是PCR假阳性的主要根源。PCR的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染。出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列。为了避免因污染而造成的假阳性,PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序,使用一次性吸头。

PCR扩增DNA片段只是一个重要手段。扩增片段的检测和分析才是目的,根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可帮助判断扩增产物的大小,有助于扩增产物的鉴定,点杂交除可鉴定扩增产物外,还有助于产物的分型;Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小,增加检测的特异性与敏感性,最近发展的一系列产物分析法(PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等)均有助于产物的精确分析。

PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,以前者最常用,通过电泳可以判断扩增产物的大小。在临床检测中,仅通过凝胶电泳判断扩增片段大小即可满足检测的需要。通常制胶方法为100mlTBE加1.5g琼脂糖在微波锅内溶解,稍冷后倒入电泳槽。

电泳后,用溴化乙淀染色20min,然后用去离子水漂洗2次,每次15min,于UV灯下观察结果并拍照。

凝胶电泳不仅可以鉴定产物的大小,检测扩增的情况,还可以用来纯化扩增产物。

当扩增产物是多条带时,用点杂交更合适。这种方法的基本过程是,首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上,再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型,用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性均不容怀疑,对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作用。但是,由于同位素不稳定和放射性危害,不能常规用于临床或法医检验,用非放射性物质(生物素、荧光素和地高辛等)标记的寡核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的方法。非放射性标记物质稳定性高,使用方便、安全、检测速度快。

该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物间接地固定于微孔板上。然后,再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域杂交,漂洗后显色即可判断结果,该法需要两个杂交过程来检测一个产物,因此,其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV的检测,其敏感度可达5个HBv DNA分子。此法的敏感性和特异性与PCR 32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害,显色反应类似于临床常规应用的ELISA,适于临床实验室常规应用。

本法避免了电泳和杂交的步骤,适于常规ELISA记数仪检测。因为5'端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列。因此,可以通过修饰一个引物的5′端使其携带便于PCR产物固定的功能基因,而通过另一引物5′-端的修饰使产物便于检测。

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