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反转录

反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程。是DNA生物合成的一种特殊方式。反转录是进行基因工程过程中,以RNA为模板提取出DNA遗传信息的过程。

[注]:反转录与逆转录不等同。逆转录是RNA类病毒自主行为,在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程,但地点不同,相对性的来说,反转录在体外,逆转录在体内。

反转录过程由反转录酶催化,该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶(RDDP),即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA(cDNA)。反转录酶存在于一些RNA病毒中,可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒(HIV)也是一种RNA病毒,含有反转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶,推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。

大多数反转录酶都具有多种酶活性,主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性;以RNA为模板,催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物,多为色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此没有校正功能,所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNase H活性;由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子,将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性;以反转录合成的第一条DNA单链为模板,以dNTP为底物,再合成第二条DNA分子。除此之外,有些反转录酶还有DNA内切酶活性,这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用,目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板,在反转录酶的作用下,合成出互补的DNA(cDNA),由此可构建出cDNA文库(cDNA library),从中筛选特异的目的基因,这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。

反转录的简要过程表示如下:

人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA,并以之为模板人工合成DNA。

反转录酶的作用是以dNTP为底物,以RNA为模板,tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物,在tRNA3′H末端上,按5′→3′方向,合成一条与RNA模板互补的DNA单链,这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA),它与RNA模板形成RNADNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下,水解掉RNA链,再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此,完成由RNA指导的DNA合成过程。

反转录的发现有重要的理论意义和实践意义。

(1)对分子生物学的中心法则进行了修正和补充,修正后的中心法则表示为:是指遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质,即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA,即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。某些病毒中的RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程(某些致癌病毒)。有些病毒(如阮病毒,即疯牛病病毒)以蛋白质直接形成蛋白质。

(2)在致癌病毒的研究中发现了癌基因,在人类一些癌细胞如膀胱癌、小细胞肺癌等细胞中,也分离出与病毒癌基因相同的碱基序列,称为细胞癌基因原癌基因。癌基因的发现为肿瘤发病机理的研究提供了很有前途的线索。

(3)在实际工作中有助于基因工程的实施。由于目的基因的转录产物易于制备,可将mRNA反向转录形成DNA用以获得目的基因。

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