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单克隆抗体

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群,可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。

1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上,创建立杂交瘤技术,他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠B细胞融合,成为杂交细胞系,既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性,又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养,可形成单细胞系,即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法,便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体,其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的,而且在培养过程中,只要没有变异,不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。

这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题,可用于探讨

①蛋白质的精细结构;

②淋巴细胞亚群的表面新抗原

③组织相容性抗原;

④激素和药物的放射免疫(或酶免疫)分析;

⑤肿瘤的定位和分类;

⑥纯化微生物和寄生虫抗原;

⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法 (“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合,将药物带至病灶部位。因此,单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究,为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。

1. 免疫动物

免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B淋巴细胞。

2.细胞融合

采用二氧化碳气体处死小鼠,无菌操作取出脾脏,在平皿内挤压研磨,制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合,并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合,形成杂交瘤细胞。

3.选择性培养

选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞,一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中,未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性,因此能在HAT培养基中存活和增殖。

4.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化

在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞,只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞,因此,必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法,筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞,并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后,及时进行冻存。

5.单克隆抗体的大量制备

单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。

(1)体内诱生法 取BALB/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后,腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖,并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周,可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,即可获得大量单克隆抗体。

(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中,杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体,收集培养上清液,离心去除细胞及其碎片,即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现,大大提高了抗体的生产量。

抗原,是指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答,并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合,发生免疫效应(特异性反应)的物质。

抗原的基本特性有两种,

一是诱导免疫应答的能力,也就是免疫原性,

二是与免疫应答的产物发生反应,也就是抗原性。

很多物质都可以成为抗原,抗原的具体分类可以参见抗原,在进行单克隆抗体制备过程中,很多物质都可以成为抗原,在常规的科研实验中,科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug重组蛋白偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。

单克隆抗体制备的宿主动物一般选用BALB/c小鼠,鼠单抗的应用范围相当广泛,一些国内外公司均开发出了兔的单克隆抗体制备技术。

免疫原分为可溶性抗原和颗粒性(细胞)抗原,用无菌盐水稀释并与佐剂混合,腹腔注射抗原与佐剂彻底混匀后形成的稳定乳状液,在免疫原提供持续的免疫应答基础上进行加强免疫

周期第1天 采血0.2ml(获得0.1ml免疫前血清)

第一次免疫(抗原加弗氏完全佐剂

第14天 第二次免疫(抗原加弗氏不完全佐剂

第21天 采血和ELISA检测

第35天 第三次免疫(抗原加弗氏不完全佐剂)

第42天 采血和ELISA检测

第56天 第四次免疫(抗原溶于PBS或盐水)

第61天 细胞融合

细胞融合的方法有物理法,如电融合、激光融合,化学融合法和生物融合法,如灭活的仙台病毒,此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇(PEG),在分子量为200~700时,呈无色、无臭的粘稠状液体,分子量大于1000时,呈乳白色蜡状固体,能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂,对热稳定,与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者,常用浓度为50-,pH8.0~pH8.2(用10-NaHCO3调整),分子量小的PEG,融合效应差,又有毒性,分子量过大,则粘性太大,不易操作。50-浓度,pH偏碱时融合效应最高。也有采用30-~50-浓度的PEG加上10-二甲亚砜。不同批号的PEG,即使分子量相同,但融合率却有明显差异,选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的,一般选供气相色谱用的PEG。

融合的方法很多,常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。

1.试剂与材料

(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。

(2)1640培养液100ml。

(3)完全1640液100ml。

(4)2.5-FCS-1640液50ml。

(5)HAT培养液100ml。

(6)50-PEG:取分子量4000,高纯度的(日本进口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌,使用前用预热于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合,以酚红检查pH,一般不必调pH。如pH有改变,可用HCl或NaHCO3调整。

(7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。

(8)40孔塑料培养盘。

2.操作方法

⑴准备好脾细胞。

⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞,并加入50ml2.5-FCS-1640液。

⑶室温400g离心3min,使细胞沉淀。

⑷移去上清液

⑸轻敲管底部,使沉淀流动,把沉淀管放于40℃水浴中,使其达融合温度。

⑹加预热至40℃的50-PEG0.8ml,用1ml吸管缓慢滴加,边加边摇沉淀管,肉眼观察可见有颗粒出现,滴加过程要求持续2min。

⑺加1ml1640液,边加边摇动,持续1min。

⑻重复⑺一次。

⑼加1ml1640液,边加边摇动,持续0.5min。

⑽重复⑼一次。

⑾加1640液15ml。

⑿室温,400g离心1min,使细胞沉淀。

⒀去上清,轻敲管底部,加25ml含有HAT的完全1640液。

⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液,每孔1滴(约0.05ml)。

⒂轻摇后,放入5-CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。

⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液,勿将固定于孔底的细胞吸出,根据需要加入适量的饲养细胞

⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察,大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现,但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后,吸取上清液,检查抗体。

⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中,依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10-FCS-1640液。同时保存于液氮和进行克隆化,在这期间每代都要检查抗体,以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

1.技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。

2.融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个无毒无菌的操作环境。

克隆化的细胞可以在体外进行大量培养,收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限,其不能超过特定的细胞浓度,且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠(无胸腺的裸鼠),杂交瘤细胞就开始无限地繁殖,直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体,这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1000倍。

利用免疫抑制剂,如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等,可以加速和促进肿瘤的生长。

1.材料

(1)经高压灭菌的降植烷

(2)Balb/c鼠:5~8周龄

(3)杂交瘤细胞:取对数生长期的细胞。

(4)RPMI1640培养液

(5)新生牛血清

2.操作方法

(1)于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,注射后1~9周内种植细胞。

(2)收取对数生长期的杂交瘤细胞,用5-FCS1640液洗涤一次,1000r/min离心10min。

(3)取样,用台盼兰染色,计活细胞数,重新用5-FCS1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。

(4)给注射了降植烷小白鼠接种杂交瘤细胞,每只腹腔注射1ml(含1.0×107个细胞/ml)。

(5)接种后10天左右时间肿瘤体积最大,此时可由腹腔抽取腹水,每隔1~3天取1次,可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。

1.材料(1)20mMol/LpH7.8~7.9TrisHCl缓冲液

20mMol/LNaCl

(2)20mMol/LpH7.8~7.9TrisHCl缓冲液

40mMol/LNaCl

(3)20mMol/LpH7.8~7.9TrisHCl缓冲液

80mMol/LNaCl

(4)20mMol/LpH7.8~7.9TrisHCl缓冲液

(5)饱和硫酸铵

(6)DEAE纤维素柱

2.操作方法

(1)小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后,于1.00×105转离心30min,去沉淀。

(2)在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液,边加边搅拌,使溶液最终为50-硫酸铵浓度。

(3)此溶液置冰中30min~60min,然后5000r/min离心10min,去上清。

(4)将沉淀溶于Tris-HCl缓冲液(40mMol/LNaCl)中(溶液可能混浊)。

(5)装入透析袋于Tris-HCl缓冲液(20mMol/LNaCl)中透析除盐。

(6)离心去沉淀。(7)溶液稀释(1:100或更高倍稀释)后,于280nm测蛋白含量,估计蛋白质含量1A280unit=0.8mg蛋白质一般每ml腹水中,含有总蛋白约25mg~36mg。

(8)过DEAE纤维素柱:纤维素柱高40cm,以20mMol/LNaClTris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。

样品进入柱床速度为1ml~2ml/min,以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脱,也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L~150mMol/LNaCl洗脱。测OD280nm收集蛋白峰,单克隆IgG保存备用。

杂交瘤产生各种免疫球蛋白,但主要是IgG和IgM,究竟是哪种为主,则决定于抗原的免疫程序。免疫一次,且3天后就取脾,多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。

1.杂交瘤细胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行。

2.单克隆抗体的类型、亚型的测定:购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清,采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。

ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型的试剂盒说明书

本试剂盒利用双抗体夹心法鉴定小鼠淋巴细胞杂交瘤培养上清中单克隆抗体或特异亲和纯化的单克隆抗体的类和亚类(可区分出IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\IgM\IgA)。采用小鼠抗体共有位点的二抗包被微孔板,与加入的培养上清中的小鼠抗体结合,再加入HRP标记的抗小鼠各类、亚类的抗体来分别反应,最后用TMB底物系统显色并用稀硫酸终止,再通过酶标仪检测吸光度来判断被测单克隆抗体的类或亚类。本试剂盒具有极高的分辨率,是您鉴定小鼠单克隆抗体类、亚类的可靠工具。

用于小鼠单克隆抗体Ig类、亚类的鉴定以及相关内容的研究。

1.首先将试剂盒恢复室温(大约30分),然后用纯水把清洗液配成工作浓度(一份浓缩清洗液加19份纯水)。

2.取出酶标板。每个标本需要6孔,阳性对照6孔。多余的用自封袋保存,记得放入干燥剂。

3.将细胞培养上清(或特异亲和纯化的抗体)50μl加入酶标微孔板,每个标本加6孔,阳性对照也是加6孔每孔50μl。然后每孔再加入50μl标本稀释液。贴上封板膜37℃温育30分钟。

4.弃去板内液体,洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍。再在每个标本的6孔中分别加入6种酶标二抗各100μl,通用阳性对照的6孔也一样。在加样图上或酶标板上做好标记。贴上封板膜37℃温育30分钟。

5.吸弃板内液体,洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍。每孔分别加入显色剂A和显色剂B各50μl,换一张新的封板膜贴板避光37℃显色20分钟。

6.本试剂盒特异性好一般肉眼即可观察出结果,看显色蓝的那个孔所对应的酶标二抗就知道此标本的Ig类或亚类。更可将反应终止液(每孔50μl)终止反应后用酶标仪450nm测定波长,630nm参考波长双波长测定结果,参看高值孔所对应的酶标二抗就知道此标本的Ig类或亚类。阳性对照0D小于0.5实验无效,需要重做。

高灵敏度、高特异性、结果容易判定。当然您如果觉得很多试剂自己可以准备想省一笔费用,那您可以登陆网站选择我们为您准备的简装抗体鉴定产品C030215。当然您也可以下次把标本交给我们来做并且不会增加太多费用!!

2-8℃避光保存效期一年。不正确存放或过于频繁开启使用有可能因此使效期缩短。

1.虽然本试剂盒过期后很久还有使用价值但还是请您在有效期内使用。

2.在检测腹水类单抗时要稀释到1/5万,虽然可以分辨但并不建议您这样做。此类样品成分十分复杂,有干扰结果的可能。在此种情况下您可以选择本公司的C030215抗体鉴定试剂。它会给您带来满意的结果。

3.手洗板子时一定要把孔加满,停留10秒然后弃尽,最后要拍干净。特别是在酶标二抗温育后洗板时一定要把酶吸出而不是甩出,要吸净。这个在手工洗板时对结果很重要。

4.一次没用完的板子要带干燥剂放自封袋封好,随盒存放。

5.拿放板子时不要剧烈抖动,以免孔间交叉污染出现错误结果。

6.出现异常结果请随时咨询我们。

单抗的特异性鉴定可以采用各种方法,如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等,同时还需做免疫阻断试验等。

单抗的效价测定可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应,腹水效价可达5×104。而采用ELISA检查,腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。

必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。

经过抗体测定的阳性孔,可以扩大培养,进行克隆,以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长,互相争夺营养和空间,而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早,太早细胞性状不稳定,数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞,经过一段时期培养之后,也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失,使部分细胞丧失产生抗体的能力,所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说,免疫性强的抗原克隆次数可少一些,但至少要3~5次克隆才能稳定。克隆化的方法很多,包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。

(一)有限稀释法

1.材料

(1)微量培养盘,盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞(即饲养细胞)每孔2万~4万。

(2)HT培养基

2.操作方法

(1)取出抗体阳性孔细胞,用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色,计数。

(2)用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。

(3)用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘,每孔0.05ml,细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。

(4)5-CO2饱和湿度,37℃培养。

(5)每天用倒置显微镜观察克隆生长情况,选择只有一个集落生长的孔,弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。

(6)克隆大量繁殖后,布满孔底的1/3~1/2时,测培养液抗体。

(7)抗体阳性孔细胞,移到有饲养层的组织培养瓶中,并传2~4代就可以脱离饲养细胞,建成克隆株。

(二)软琼脂克隆化借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长,而达到克隆化,具体操作如下:

1.配2.5-的琼脂糖30ml,水浴溶化后,移入45℃水浴中。

2.将117ml完全DMEM液和3ml10倍浓度的DMEM液混合,置45℃水浴预热。

3.将琼脂糖与DMEM液混合,即为含0.5-琼脂糖的完全DMEM液,并加75×108脾细胞。

4.每块平皿加10ml,于室温中凝固。

5.DMEM中的细胞与DMEM琼脂1:1混合,将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上,使其全部覆盖。

6.放入CO2箱饱和湿度,37℃培养10天。

7.用PBS配制0.6-琼脂糖,于沸水浴溶解后,置45℃,在保温情况下取一试管,迅速加入0.1ml25-羊红血球,0.2ml豚鼠补体,2.7ml0.6-琼脂糖。

8.用3ml琼脂糖羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围,可筛选抗羊红血球Ig。

(三)显微镜操作法

在直径6cm培养皿中,加入1ml1.0×108细胞悬液放置5-CO2饱和湿度,37℃温箱中放置30min以上,倒置显微镜下,寻找那些与周围相距甚远的单个细胞,将毛细管口(一头有直角弯头毛细管,一头连接一尺长乳胶管,用口控制液体进入)水平置放于液面上,左右微动,直到看见管口,对准细胞,吸入毛细管,将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内,培养后,即可获得单个细胞形成的克隆。(四)荧光激活分离法

用一种荧光激活细胞分类器(FluoresceinActivafedCellSorter,FACS)。其基本原理是:将细胞经荧光抗体染色后,经喷嘴形成单个细胞的线形液滴,在莱塞光激发下,荧光素发射荧光,此信号由光电倍增管接收,再结合细胞形态大小产生光散射信号,经电脑处理,产生信号并与预定的信号对比,根据细胞荧光强度及细胞大小不同,将细胞分成不同级别,在电场中发生偏离,而分别收集于不同容器中。

(一)脾细胞

1.材料

(1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。

(2)1640培养液(3)2.5-FCS-1640营养液

2.操作方法

(1)拉颈或用CO2处死小白鼠。

(2)将小鼠放于70-酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾。

(3)把脾放入5ml含有2.5-FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。

(4)用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中。

(5)直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中。

(6)以2.5-FCS1640充满离心管,并以400g离心7min~10min(与此同时应开始制备骨髓细胞)。

(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮

(8)重复⑹、⑺步骤。

(9)计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80-为合格。

(二)骨髓瘤细胞

骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响或降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。

选择骨髓瘤细胞的条件:

①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者的组织相容性抗原一致;

②骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外;

③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml;

④生长速度快,繁殖时间短。

常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有:

①S194/5XXOBU1;

②SP2/0Ag14(简称SP2);

③P2X­Ag8653(简称653);

④FO以653最为常用,它是由矿物油4-甲基-15烷(Pristane,降植烷)诱发出来的一种浆细胞瘤(MinerolOilplasmacytoma,MOPC)并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象,在融合前,可将培养基内加入15μg/ml8-氮鸟嘌呤。取约1×107~6×107对数生长期(即培养15h~20h)的骨髓瘤细胞,在室温离心(400g)10min,沉淀以2.5-FCS1640液再悬浮并计数。

(三)饲养细胞

在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞(Feedercell)。在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。

应用腹腔渗出细胞的好处是:

一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等。

1.材料

(1)小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只。

(2)11.6-蔗糖溶液(经10磅30min高压灭菌)。

2.操作方法

(1)拉颈处死小鼠。

(2)70-酒精浸泡消毒10min。

(3)用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔。

(4)用注射器将4ml11.6-蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体,加入离心管。

(5)1000r/min离心10min。

(6)弃上清,以HT培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞,使每毫升含40万个活细胞。

(7)以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔0.05ml,含2万个细胞,放入CO2培养箱培养,即可供细胞融合克隆化之用.

单克隆抗体问世以来,由于其独有的特征已迅速应用于医学很多领域。主要表现在以下几个方面。

1.检验医学诊断试剂

作为检验医学实验室的诊断试剂,单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点,广泛应用于酶联免疫吸附试验放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用,很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。

应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于:

病原微生物抗原、抗体的检测;

肿瘤抗原的检测;

免疫细胞及其亚群的的检测;

④激素测定;

细胞因子的测定。

单克隆抗体对抗原的识别,与多克隆抗体有很大的不同。不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同,识别抗原的位点不同,导致检测结果有一定差异。因此,标准化问题还需要进一步研究。

2.蛋白质的提纯

单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质(如Speharose 2B、4B、6B等)上,并制备成层析柱。当样品流经层析柱时,待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合,其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后,改变洗脱液的离子强度或pH,欲分离的抗原与抗体解离,收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。

3. 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术

将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接,利用单克隆抗体的导向作用,将药物或放疗物质携带至靶器官,直接杀伤靶细胞,称为肿瘤导向治疗。另外,将放射性标记物与单克隆抗体连接,注入患者体内可进行放射免疫显像,协助肿瘤的诊断。单克隆抗体主要为鼠源性抗体,异种动物血清可引起人体过敏反应。因此,制备人-人单克隆抗体或人源化抗体更为重要,但此方面仍未取得明显进展。

1.单克隆抗体的优点

(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代,只要不发生细胞株的基因突变,就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。

(2)可以用相对不纯的抗原,获得大量高度特异的、均一的抗体。

(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体,所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,如IRMA和ELISA等。

(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能,可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。

2.单克隆抗体的局限性

(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应,所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。

(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。

(3)制备技术复杂,而且费时费工,所以单克隆抗体的价格也较高。

单克隆抗体药物的发展起源于1975年,杂交瘤技术的问世使大量制备均一的鼠源单克隆抗体成为可能。1986年第一个抗移植后免疫排斥反应的鼠源单克隆抗体muromonab-CD3(OKT3),经美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准上市, [1] 但是来源于鼠源淋巴细胞杂交瘤的抗体被人的免疫系统识别,会引起严重的人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody,HAMA),不仅使治疗性单抗半衰期变短,疗效减弱,有时还会引起严重的不良反应。 [2]

单克隆抗体药物的发展在1988年到1993年间陷入低谷。随着重组DNA技术的发展,各种抗体人缘化技术迅速发展,单克隆抗体药物经历了人鼠嵌合单抗、人源化单抗阶段。随后出现的噬菌体展示文库技术和转基因小鼠技术,使全人源单抗的产生成为可能,2002年第一个全人源抗体阿达木单抗上市。 [3]

单克隆抗体在医药治疗上有广泛的前景,被用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病。 [4] 阿达木用于缓解抗风湿性药物(DMARD)治疗无效的结构性损伤的中至重度类风湿关节炎(RA)。

单克隆抗体的发展经历了四个阶段,分别为:

鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。 [5-7]

全人源单克隆抗体:其抗体的可变区和恒定区都是人源的,去除免疫原性和毒副作用。

全人源抗体制备的相关技术主要有:

人杂交瘤技术、EBV 转化 B 淋巴细胞技术、噬菌体显示技术(phage display)、转基因小鼠抗体制备技术(transgenic mouse)和单个B细胞抗体制备技术等。

由人源化和全人源抗体制备的人源化和全人源抗体药物因其具有高亲和力、高特异性、毒副作用小的特点,克服了动物源抗体及嵌合抗体的各种缺点,已经成为了治疗性抗体药物发展的必然趋势。

阿达木单抗作为生物单抗药物,在疗效和技术门槛方面难以挑战;另外,越来越多的医生在治疗类风湿时首选皮下注射给药的剂型,不需要注射过程和费用,虽然与依那西普的对比临床试验还未出来,但是人们普遍认为阿达木单抗的疗效更好。 [8]

销售及增长

2010年全球治疗用单抗药物的销售总额达到440亿美元,如果加上100亿美元的单抗诊断和研究试剂,单抗药物的市场总量达到550亿美元。2011年单抗药物的市场总量已经达到628亿美元。未来,全球单克隆抗体药依旧会保持较高的增长率。到2015年,全球单克隆抗体药销售额有望达980亿美元左右。我国的单克隆抗体药物从无到有,并且在我国医药市场发挥越来越重要的作用。目前我国单抗市场规模每年以50-以上的速度递增。单克隆抗体在我国市场仍属高端产品,主要依赖进口。罗氏是我国单抗市场最大的赢家,市场份额最高的品种利妥昔单抗和曲妥珠单抗均来自罗氏制药,罗氏所有产品份额超过国内单抗产品份额半数。2010年我国肿瘤药物市场销售额达160亿元,同比增长24-,全球排名第七,远超美国4.4-和其他成熟或新兴市场;2011年市场销售额达到208亿元。同比增长率30-。对生物仿制药的市场渗透率形成制约的其中一个因素是立法,它阻止了用生物仿制药来替代原研产品。这意味着,生物仿制药的使用只限于新病人和短期适应症。然而,使用生物仿制药创造的医疗成本控制机会却是巨大的。在那些尚未为生物仿制药确定监管路径的市场上(其中包括美国),生物仿制药获得成功的关键因素是专利的独有性、临床试验要求和互换性。

研发的政策支持

“十二五”期间,我国“重大新药创制”专项将获中央财政下拨资金100亿元,配套资金300亿元。专项战略重点包括创新药物研究开发、药物大品种技术改造等。恶性肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病、肺结核等10类重大疾病药物的研发是创制资金支持重点。

“十二五”期间,医药工业发展目标为总产值年均增长20-,到2015年达到3.1万亿元。

2011年,单克隆抗体药物继续领跑全球药品市场,同比有较大的增长。

2000-2010年10年间,全球单克隆抗体药物市场的复合增长率高达32-。

2011年,全球处方药前20位中,有6个为单克隆抗体药物,其中有5个销售额超过50亿美元。而在此前的2009年和2008年,该数字分别为400亿美元和370亿美元。当前,几乎所有大型制药公司都有单抗研发项目。

在2011年全球最畅销的20种药品中,美国辉瑞公司用于降低胆固醇的阿托伐他汀钙居于首位,达到133亿美元。2011年,全球生物制药产品的市场规模超过1550亿美元,占制药/生物制药产品的25-。不过,有研究数据表明,生物制药产品今后几年在全球市场上的占比将明显上升。

据预测,到2014年,全球销售额前三大产品都将是生物技术药物(Avastin,Humira和Enbrel),届时它们的销售额合计将达到254亿美元。

单克隆抗体药物已经成为生物制药中最为重要的一类,2011年销售规模最大的7种抗体药物的销售额达到了388.2亿美元,占整个生物制药市场份额接近50-;单克隆抗体仍是研发的热点,也将是未来生物制药行业发展的重要动力所在。

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