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冻融法

冻融法是指采用反复冷冻与融化时由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

冻融法:将待破碎的细胞冷至-15℃到-20℃,然后放于室温(或40℃)迅速融化,如此反复冻融多次,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。

酶的提取溶剂可以用水、一定浓度的乙醇、乙二醇、丁醇和稀盐溶液、缓冲溶液等;也可以用稀碱或稀酸溶液,如用稀硫酸提取胰蛋白酶,用稀盐酸提取胃蛋白酶。溶剂用量一般为原料重量的1~5倍。搅拌可加速提取,但转速不宜太快,否则会产生泡沫而难以过滤或使酶变性。多数酶的提取要在50C以下操作,但有的酶在较高温度下提取更好,如胃蛋白酶在45℃提得收率较高,一般可在一5~+40℃间适当选择。提取液的pH应在酶的稳定pH范围内,并应远离其等电点的pH为宜,如蛋白酶选用pH 2.5~3,0,胰蛋白酶和α一糜蛋白酶则用0.25 N硫酸提取。若在中性或碱性提取时,最常用的是0.15 mol/L氯化钠、0.02~0.05mol/L磷酸缓冲液、0.02-0.05 mol/L焦磷酸缓冲液。正丁醇的亲脂性强,能透入酶的脂质结合物中,又兼有亲水性,有类似表面活性剂的作用,适用于提取“结酶”。

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